O-GlcNAcase抗原片段的选择、优化表达和多克隆抗体的制备

为了探讨O-GlcNAc修饰的生物学作用和相关疾病的发病机理,需制备高效、专一的O-GlcNAcase（OGA）抗体。通过对人源OGA蛋白进行序列分析发现,氨基端1~350 aa片段（sOGA）抗原性和亲水性较强,将该片段构建至原核表达载体pET-28a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）中进行诱导表达,通过优化IPTG浓度（0.05 mmol/L）和诱导时间（10 h）获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小（45 kDa）和纯度（95%以上）。以4-MU-O-GlcNAc为荧光底物,检测到sOGA的糖苷酶活性为106 nmol/（min.mg）,表明该片段是OGA糖苷酶的活性区域。以此片段作为抗原免疫新西兰大白兔,以CNBr活化Sepharose 4B微珠纯化抗血清制备OGA特异性多克隆抗体。Western blotting和ELISA检测表明,该抗体可以特异识别含有OGA糖苷酶活性区域的多种变体,检测灵敏度为0.11 ng/mL（效价为1∶80 000）,可应用于O-GlcNAcase生物功能研究。

人己糖胺酶D的原核表达、纯化及酶学特性研究

糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,参与生物体中的信号传导、细胞识别等多种细胞活动,糖基缀合物的正常水解是生物体代谢的必需途径。人己糖胺酶D(Hexosaminidase D)是新发现的一种存在于人细胞质中的切除GalNAc糖基化修饰的外切酶,但该酶的酶学特性尚不清楚。利用PCR的方法,将Hex D的cDNA序列构建到质粒pET3C中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后,通过优化异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度(0.1 mmol/L)和诱导时间(10 h)获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(58 kDa)和纯度(95%以上)。以4-甲基伞形酮-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(4-MU-O-GalNAc)为荧光底物,测定该酶的最适反应pH值为5.5,最适反应温度为37℃,且该酶的热稳定性较好,在50℃下放置半小时仍有较高活性,1mmol/L的金属离子(CuSO4、FeSO4.7H2O、MgCl2.6H2O、CaCl2、NiSO4.6H2O、AlCl3.6H2O、ZnSO4.7H2O、MnCl2)及EDTA对该酶活性影响不大,10mmol/L AlCl3、CuSO、FeSO4.7H2O对该酶有不同程度的抑制。在最适条件下(pH 5.5,37℃)下,该酶的Km为0.16mmol/L,最大反应速率为3.06μmol/(min.mg)。