大珠母贝种苗海区深水中间培育技术研究

开展了大珠母贝种苗不同深度和密度的养殖试验,以优化、筛选合适的养殖密度和深度,为大珠母贝养殖提供技术支撑。贝苗初始大小为平均壳长4.11 mm,平均壳高3.89 mm,平均体重0.0143 g,养殖水深包括3、5、7 m和海底(12 m)(贝苗密度为2 000个/笼),养殖密度包括500、1 000、1 500、2 000、2 500个/笼(养殖水深为5 m)。经过两个月的养殖,7 m水深的贝苗生长最快,平均壳长达30.80 mm(平均生长速度为0.41 mm/d),平均体重达3.34 g(平均生长速度为36.69 mg/d);密度为500个/笼的生长较快,平均壳长达30.15 mm(生长速度为0.42 mm/d),平均体重达3.18 g(生长速度为31.90 mg/d)。深度组中存活率最高的是海底组(12 m),为17.7%,明显高于其他3组(P<0.05),最低的是3 m组,为6.9%;密度组存活率最高的是1 500个/笼组,为15.3%,显著高于其他组(P<0.05),最低的是2 500个/笼组,为7.4%。不管是深度组还是密度组,第1个月与第2个月的平均壳长增长没有明显差异,而第2个月的平均体重增长明显大于第1个月。说明大珠母贝苗海区养殖适宜在较深水层、密度为1 500～2 000个/笼的条件下进行。

盐度对企鹅珍珠贝耗氧率和排氨率的影响

研究了企鹅珍珠贝在不同盐度下（22、26、30、34、38）耗氧率和排氨率的变化规律，旨在为其养殖管理提供科学依据。所用贝的体质量规格平均为7．46g（A组）、17．61g（B组）和28．57g（C组）。结果显示，当盐度为18时企鹅珍珠贝出现死亡，在盐度22～38范围内，耗氧率和排氨率与体质量呈负幂函数关系，可表示为Y=aW^b。随着盐度的增加，企鹅珍珠贝的耗氧率也在逐步增加，当盐度为34时，耗氧率达到峰值，当盐度继续增加时，耗氧率会降低。随着盐度的增加，排氨率一直呈上升趋势，盐度为38时，排氨率最高。当盐度在22～34之间时，3种规格企鹅珍珠贝的O：N值随盐度的升高而逐步增大，在盐度34时达到最大值，然后开始下降。根据耗氧率和O：N值的变化幅度推测其适宜盐度范围为26～34。上述结果表明，企鹅珍珠贝对低盐度适应较差，在养殖生产中应根据盐度变化调整吊养水层。

企鹅珍珠贝组织蛋白酶D的cDNA克隆、序列特征分析和应激表达研究

笔者初步研究了企鹅珍珠贝(Pteria penguin)组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)的基因克隆和功能,通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因(命名为pgCTSD)。该基因cDNA全长1 767 bp,其中5'UTR为38 bp,3'UTR为553 bp,ORF为1 176 bp,编码392个氨基酸,包括信号肽(Met1-Ala18)、前体域(Leu19-Lys47)和成熟域(Tyr48-Ser392)三部分,分子量为42.3 kDa,等电点为8.04。pgCTSD氨基酸序列与大珠母贝(Pinctada maxima)pmCTSD的相似性最高(79%),与其他物种的相似性为59%～75%。荧光定量分析表明,空白对照组中pgCTSD mRNA在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,且在闭壳肌中表达量最少,肝胰脏中最高。与试验对照组相比,脂多糖(LPS)刺激6 h后性腺和肝胰脏显著下降,闭壳肌的表达量虽不大但增加显著,外套膜和鳃组织变化不显著;哈维弧菌(Vibrio harveyi)刺激6 h后肝胰腺和外套膜显著下降,闭壳肌和鳃显著上升,性腺无显著变化。肝胰腺中pgCTSD对LPS和弧菌刺激的应答反应表明pgCTSD可能参与了免疫反应。

大珠母贝组织蛋白酶D的cDNA克隆、序列特征分析及应激表达研究

通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了大珠母贝(Pinctada maxima)组织蛋白酶D基因(命名为pmCTSD)的cDNA全长序列1 742 bp,其中5’非翻译区(UTR)38 bp,3’UTR 534 bp,开放阅读框1 170 bp,编码390个氨基酸,分子量约为41.9 ku,等电点约为7.57。序列特征分析表明,pmCTSD蛋白由信号肽(Met1-Ala18)、前体域(Leu19-Lys47)和成熟域(Thr48-Asn390)3部分组成。同源性分析表明,pmCTSD氨基酸序列与其他物种高度保守,相似性介于64%～70%之间。进化分析表明,pmCTSD与栉孔扇贝亲缘关系最近,与传统分类结果基本一致。组织表达荧光定量分析发现,pmCTSD在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,但在性腺中表达量最高,肝胰脏次之。

大珠母贝(Pinctada maxima)α-淀粉酶基因cDNA及内含子克隆分析

α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中,是贝类软体动物的主要消化酶,对贝类生长有重要影响。文章首次获得大珠母贝α-淀粉酶基因(命名为pmAMY,Pictada maxima alpha amylase),其cDNA全长1732bp,其中5'UTR 25bp,ORF 1554bp,编码518个氨基酸,3'UTR 153bp,分子量为57.7KDa,等电点7.63。氨基酸序列分析表明,pmAMY的氨基酸序列包括16个氨基酸组成的信号肽序列(MLLIVCSIAFFHSVYG)、8个半胱氨酸位点(Cys46、Cys104、Cys157、Cys176、Cys392、Cys398、Cys464、Cys476)、3个活性催化位点(Asp213、Glu249、Asp314)、4个钙结合位点(Asn118、Arg174、Asp183、His217)、3个氯离子结合位点(Arg211、Asn312、Arg350)和4段保守序列(Ile111—Val116、Val207—Ala215、Phe247—Val251、Val308—Asn315)。pmAMY的氨基酸序列与企鹅珍珠贝(Pteria penguin)同一性最高,为82%;与超嗜热古菌(Thermococcus hydrothermalis)同一性最低仅为27%;与其他物种的同一性在57%—79%之间。克隆获得大珠母贝pmAMY基因的2个内含子,长度分别为846bp、162bp。2个内含子都起始于GT,终止于AG,符合内含子共同剪接位点序列。组织表达分析表明pmAMY只在肝胰脏中表达。本研究为α-淀粉酶基因的功能分析、单核苷酸多态性(SNP,single nucleotide polymorphism)位点分离及其与生长性状的关联分析奠定了基础。

珍珠贝prismalin-14基因的组织表达与钙沉降抑制的比较分析

对大珠母贝(Pinctada maxima)和合浦珠母贝(Pinctada fucata)的棱柱层形成相关基因prismalin-14的组织表达和碳酸钙沉降抑制进行了比较研究。选取编码prismalin-14蛋白的cDNA序列插入pET-32a质粒,构建表达载体,通过IPTG诱导、亲和层析柱纯化,成功获得预期大小的融合蛋白并用于碳酸钙沉淀的抑制试验。结果表明,大珠母贝的prismalin-14蛋白对碳酸钙沉降的抑制能力比合浦珠母贝弱。组织特异性表达表明,prismalin-14基因在外套膜的表达量远高于其他组织。对大珠母贝外套膜3个不同部位的荧光定量PCR表明,prismalin-14基因在大珠母贝外套膜边缘表达量最高,在外套膜皮质部和外套膜中心表达量较低,与合浦珠母贝的表达模式相似。