接种密度对牛颗粒细胞形态及相关基因表达的影响

牛卵巢颗粒细胞是雌激素(Estrogen,E_(2))合成的主要来源,具有E_(2)活性的牛颗粒细胞体外模型的建立是研究E_(2)合成与分泌过程中潜在调控机制的重要工具,该细胞模型的建立可为E_(2)合成分子调控机制及牛卵巢卵泡发育机制的研究提供理论与技术支持。细胞接种密度是颗粒细胞体外培养模型的关键因素,高密度可引起细胞生理及分子的显著变化。研究通过不同接种密度下的形态变化和基因表达筛选牛颗粒细胞体外培养最优接种密度,采用长期无血清法培养牛原代颗粒细胞,培养液中添加FSH及IGF-1以诱导E_(2)的合成。培养7 d后,采集6孔板中高(3.0×10^(6)个细胞/孔)、中(2.0×10^(6)个细胞/孔)、低(1.0×10^(6)个细胞/孔)3种不同接种密度的细胞图像进行观测,并利用qRT-PCR技术检测3种不同接种密度中相关基因的表达情况。结果表明,低密度(1.0×10^(6)个细胞/孔)接种细胞呈现成纤维细胞样外观,细胞无聚集倾向;中密度组(2.0×10^(6)个细胞/孔)可观察到少量聚集的细胞团;高密度(3.0×10^(6)个细胞/孔)培养条件下,大多数细胞聚集成细胞团。低密度组(1.0×10^(6)个细胞/孔)中,CYP19A1及FSHR高表达,RGS2及VNN2低表达;高密度组(3.0×10^(6)个细胞/孔)表达量则相反。综上所述,低密度组(1.0×10^(6)个细胞/孔)细胞可作为具有E_(2)活性的牛颗粒细胞体外模型。

牛卵泡颗粒细胞CART与候选受体的分子对接及其功能

通过同源建模预测牛卵泡颗粒细胞(GCs)可卡因-苯丙胺转录肽(CART)与候选受体ZMPSTE24的三维结构,运用分子对接技术分析二者的结合模式,探究其分子互作关系;选取3头健康成年母牛,分离GCs,转染TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默序列,提取总RNA,并采用q RT-PCR检测TEDDM1、AGTR2、CMKLR1、ZMPSTE24等4个候选受体沉默后m RNA的相对表达量;采用CCK-8法测定各试验组和对照组GCs增殖情况;采用ELISA法检测各组培养液中雌激素(E2)的质量浓度,研究此4个候选受体在牛卵泡GCs中的功能。结果表明:ZMPSTE24与CART存在1个结合位点、9个盐桥、17个氢键;4个候选受体试验组的m RNA相对表达量均极显著(P<0.01)低于si NC组和空白组的,表明TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24在GCs中沉默效果良好;TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默后,各试验组的细胞增殖率和培养液中E2质量浓度均极显著(P<0.01)低于阳性对照组(不加CART)的。可见,4个候选受体基因沉默后,CART对GCs增殖和E2分泌仍具有抑制作用。

西门塔尔牛无角性状的分子鉴定及应用

为鉴定西门塔尔牛有角和无角性状的相应基因型,为西门塔尔牛无角品系的培育提供数据基础,试验采集了103头无角西门塔尔牛、5头有角西门塔尔牛和5头无角安格斯牛颈静脉血,提取全血DNA后,通过PCR-测序法检测牛PC基因中P202ID突变位点的基因型。分型与测序结果显示,108头西门塔尔牛P202ID位点的基因型与角型完全一致,其中,103头无角西门塔尔牛中4头为纯合子,基因型与无角安格斯牛一致,均为PC/PC,PC的基因频率为0.0370;82头为无角杂合子,基因型为PC/prs,其中,PC的基因频率为0.7593;剩余17头去角西门塔尔牛与5头有角西门塔尔牛基因型一致,均为prs/prs,prs的基因频率为0.2037。鉴定群体中PC的基因频率为0.4166,prs的基因频率为0.5834。卡方检验结果显示,P202ID基因型与检测群体中有无角性状具有极显著关联,可以利用P202ID位点对西门塔尔牛角型进行鉴定。

牛卵泡颗粒细胞CART相互作用蛋白鉴定及受体筛选

旨在筛选牛卵泡发育关键负调控因子可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)的相互作用蛋白及其受体。本研究采集3头健康母牛双侧卵巢,分离卵泡后刮取颗粒细胞(granulosa cells,GCs)混样;采用跨膜蛋白Extraction试剂盒提取膜蛋白,运用Protein G琼脂糖磁珠与重组CART蛋白、Anti-CART抗体共孵育(n=3);洗脱CART-蛋白复合物进行二级质谱(LC-MS/MS)分析;获得的蛋白经可信度过滤,利用生物信息学技术对其进行功能聚类分析,通过CELLO V2.5软件对蛋白进行亚细胞定位和跨膜区分析;获得7次跨膜的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs),经ProtScale软件分析其胞内外结构区段特点,符合神经肽与受体结合结构特点的GPCR作为CART的候选受体。抽提的膜蛋白经免疫亲和层析(n=3)后,分别鉴定出149、557和298个相互作用蛋白,经筛选剔除重复蛋白,共鉴定出620个蛋白。多数据库集功能富集分析表明,CART相互作用蛋白包含参与信号传导活性的GNAS、GNG8和JUP,参与类固醇生物合成的HSD3B,参与细胞凋亡或增殖调节的OPA1和S100A11,参与Notch信号通路的ERH,这些蛋白或信号通路均与牛卵泡发育密切相关。亚细胞定位和跨膜区分析共获得膜蛋白156个,占总蛋白数的20.53%;其中7次跨膜的GPCRs有8个。经TMHMM分析表明,8个GPCRs中仅ZMPSTE24、HM13和GPR108的N端在胞外,C端在胞内,与神经肽受体的结构特征一致;经PredictProtein结合位点分析表明,ZMPSTE24在5~6跨膜区间的胞内环存在G蛋白结合的位点。ZMPSTE24作为CART的候选受体,有待于分子互作和功能试验进一步加以验证。本研究为牛卵泡CART受体的鉴定奠定了基础,对丰富牛卵泡发育调控理论具有重要意义。

牛卵泡CART受体的筛选及其表达特性分析

旨在筛选可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide, CART)的受体,明确其受体在优势卵泡(dominant follicles, DF)和从属卵泡(subordinate follicles, SF)的表达特性。本研究使用琼脂糖Protein A/G磁珠免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)鉴定CART及其相互作用蛋白;利用HMMTOP V2.0分析其跨膜次数并获得G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors, GPCRs);运用SWISS-MODEL和PDB数据库对CART和筛选出的GPCRs同源建模,获得模型分子的PDBQT文件,并通过评分函数对构建模型质量和每个氨基酸残基的模型质量进行评价;将CART和待分析受体PDBQT文件输入ZDOCK进行分子对接,获得复合体立体空间模型和评分函数值;利用qRT-PCR和免疫组织化学技术对筛选出的靶蛋白趋化因子样受体1(chemokine-like receptor 1, CMKLR1)在牛DF和SF中的表达及定位进行分析。Co-IP获得的111个蛋白质组分中包含10个膜蛋白,分别为A2M、C5、CMKLR1、COX2、DDOST、HEATR5A、B3AT、ADT2、RPN2、SLC4A1;其中CMKLR1具有7次跨膜的α螺旋结构,属于GPCRs;利用SWISS-MODEL建模技术构建CART和CMKLR1的分子模型,ZDOCK分子对接后获得复合体立体空间模型,其中评分函数值最高为1 977.34。qRT-PCR分析表明,CMKLR1 mRNA在SF中的表达量显著高于DF(P<0.05);免疫组织化学分析结果表明,CMKLR1存在于牛DF和SF颗粒层、膜层,在SF颗粒层和膜层细胞显色强度均高于DF,这与qRT-PCR的分析结果相一致。结果显示,蛋白同源建模和分子对接技术应用于受体筛选是可行的。CMKLR1作为神经肽CART的候选受体,在SF的表达量显著高于DF,该研究对CART受体的鉴定及深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。

bta-miR-377靶向调控牛下丘脑CART基因表达的研究

【目的】分析bta-miR-377与牛卵泡发育的关键调控因子可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)间的靶标关系,明确bta-miR-377对牛CART表达影响的作用机制。【方法】本研究通过生物信息学手段预测bta-miR-377与牛CART基因mRNA的结合位点,并对miR-377在不同物种间的序列保守性进行分析;利用双荧光素酶报告基因法验证bta-miR-377与CART基因的靶标关系;选择3头健康西门塔尔母牛,采集其下丘脑组织,分析bta-miR-377和CART基因在牛下丘脑中的内源表达情况;以PC12和293T细胞为模型进行细胞功能验证,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分别转染bta-miR-377 mimics和NC mimics后的PC12细胞中CART基因mRNA和293T细胞中CART蛋白表达丰度变化。【结果】bta-miR-377在CART 3′-UTR上存在靶向结合位点,并能极显著下调CART 3′-UTR野生型重组双荧光质粒的相对荧光活性(P<0.01),且结合位点序列在多个物种中高度保守;在牛与大鼠间,miR-377种子区序列保守性较低;bta-miR-377和CART在牛下丘脑中均有表达;过表达bta-miR-377 mimics能够极显著下调CART基因mRNA的表达(P<0.01),显著下调CART蛋白的表达(P<0.05),bta-miR-377与CART的表达存在负相关关系。【结论】bta-miR-377和CART在牛下丘脑组织中均有表达,bta-miR-377能够通过与CART 3′-UTR特异性结合抑制PC12细胞中CART mRNA的表达。

bta-miR-377琼脂糖凝胶电泳条件优化

bta-miR-377与下丘脑分泌的可卡因苯丙胺调节转录肽(Cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)存在靶向结合关系。为分析bta-miR-377在牛下丘脑组织中的表达情况,为后续探讨bta-miR-377与CART相互作用进而影响牛卵泡发育的作用机制奠定基础,经Trizol法提取牛下丘脑总RNA,采用茎环结构法设计特异性引物,并利用半定量RT-PCR技术克隆bta-miR-377,观察不同条件琼脂糖凝胶电泳后Marker和目的条带的分离情况,其中凝胶浓度为2.0%、2.5%;电压为100、80 V;时间为40、60、80 min;同时通过Image J软件对不同条件下获得的bta-miR-377条带进行灰度值分析,结合电泳结果确定最佳分离条件。结果显示,利用茎环结构法能够达到延长bta-miR-377片段的目的,且特异性强;凝胶浓度为2.5%、电压为80 V、时间为80 min时,bta-miR-377条带分离效果好且表达量高,该条件下条带的灰度值与其他组相比差异显著,与电泳分析结果一致,说明低浓度凝胶的分辨率低,长时间高压会导致DNA降解进而使条带弥散,而适当电压下电泳时间过短会使DNA分子无法聚集而使条带过宽,说明适宜的电泳条件是鉴定目的 miRNA表达的关键。综上可见,bta-miR-377在牛下丘脑中有表达,丰富了动物生殖生理学中下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌调控理论。

Mimics转染PC12细胞条件的优化

PC12作为模式细胞已被广泛应用于多种疾病研究。为探究高效、低毒的PC12的细胞转染方法,试验采用化学转染法,以带有5′-羧基荧光素(FAM)标记的NCmimics作为外源基因,分别用RFect、D-Portal、Tran⁃sIntro^(TM)EL、Lipofectamine 3000和Lipofectamine 2000等5种转染试剂转染PC12细胞以筛选最佳转染试剂;然后设置NC-FAMmimics浓度为50、60、70、80、90、100 nmol/L,通过倒置荧光显微镜观察PC12细胞在最佳转染试剂下的荧光信号对转染效果进行评定。结果表明,在相同的培养条件下,不同转染试剂对PC12细胞的转染效果之间存在较大差异,其中,TransIntro^(TM)EL转染后荧光强度最高,D-Portal、Lipofectamine 3000和Lipofectamine 2000转染后荧光信号次之,RFect转染后荧光信号最弱;且不同处理对细胞损害无显著差异。以TransIntro^(TM)EL作为最佳转染试剂进一步优化NC-FAMmimics转染浓度发现,荧光强度随NC-FAMmimics浓度的增加呈现先增强后降低的趋势,且在NC-FAMmimics浓度为70 nmol/L时荧光信号最强;此外不同浓度下的细胞数量无显著差异。综上可见,以TransIntro^(TM)EL作为转染试剂、NC-FAMmimics浓度为70 nmol/L时,转染后PC12细胞荧光强度最高,转染效果最好。

牛下丘脑lncRNA SNHG3的筛选及其调控CART表达的功能鉴定

本研究旨在筛选调控牛下丘脑可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)表达的长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)小核仁RNA宿主基因3 (small nucleolar RNA host gene 3,SNHG3),明确lncRNA SNHG3调控牛下丘脑CART表达的作用机制。利用Star Base v2.0、NCBI、DIANA tools数据库预测分别与极显著抑制CART表达的miR-381、miR-491存在靶向关系的lncRNAs,分析其结合位点;选取3头健康成年西门塔尔母牛,提取其下丘脑组织总RNA,通过半定量RT-PCR技术鉴定所筛选的lncRNAs内源表达情况;双荧光素酶报告基因技术检测miR-381/491与lncRNAs间的靶向结合关系;构建lncRNAs、CART过表达载体及miR-381/491 mimics,分别转染至293T细胞,分析lncRNAs对CART基因表达的调控作用机制;利用动物活体实验对在细胞水平调控作用效果最强的lncRNA进行功能分析。lncRNA TUG1、SNHG3与miR-381存在结合位点,lncRNA H19、SNHG12、DANCR与miR-491存在结合位点,且lncRNA TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR均在牛下丘脑中有表达;双荧光素酶检测结果显示,miR-381显著抑制TUG1-WT重组荧光质粒的相对荧光活性(P<0.05),极显著抑制SNHG3-WT重组荧光质粒的相对荧光活性(P<0.01);miR-491显著抑制DANCR-WT和H19-WT的荧光素酶活性表达(P<0.05),极显著抑制SNHG12-WT荧光素酶活性表达(P<0.01);在细胞水平,lncRNA SNHG3通过特异性结合miR-381极显著提高CART表达(P<0.001),lncRNA SNHG12通过特异性结合miR-491极显著提高CART表达(P<0.01),其中,lncRNA SNHG3调控CART表达效果最强;动物实验结果表明,lncRNA SNHG3通过特异性结合miR-381显著提高CART m RNA和蛋白表达。本研究证实了lncRNA SNHG3作为miR-381的竞争性内源RNA (competing endogenous RNAs,ce RNA),在转录和转录后水平均显著上调CART表达,为进一步研究牛下丘脑CART的分子网络调控机制奠定了基础。