ADAM12异常表达对大骨节病患者软骨细胞损伤及IGFBP相关基因的影响

目的探讨解整合素金属蛋白酶12(ADAM12)基因在大骨节病患者软骨细胞损伤中的作用及其对胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)相关基因的影响。方法由就诊于西安交通大学附属红会医院的5例大骨节病患者和5例对照受试者获得关节软骨样本,体外提取并培养关节软骨细胞。分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测大骨节病患者与对照受试者软骨细胞ADAM12 mRNA和蛋白表达水平。然后,采用慢病毒进行大骨节病患者软骨细胞ADAM12基因过表达实验,MTT法检测ADAM12基因过表达后细胞活性变化,并采用qRT-PCR检测软骨细胞分化相关基因Y染色体性别决定区-盒转录因子9(SOX9)、Ⅱ型胶原(COLⅡ),凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(BAX)以及合成代谢相关基因IGFBP3、IGFBP5 mRNA表达水平。结果大骨节病患者软骨细胞ADAM12 mRNA和蛋白表达水平(0.57±0.05、0.81±0.07)均显著低于对照受试者(1.00±0.00、1.00±0.00),差异均有统计学意义(t=-24.50、-3.61,均P<0.05)。MTT法结果显示,ADAM12过表达组软骨细胞活性(1.09±0.05)高于空载体对照组(1.00±0.08),差异有统计学意义(t=4.12,P=0.031)。qRT-PCR结果显示,与空载体对照组比较,ADAM12过表达组IGFBP3(2.35±0.79比0.96±0.25)、IGFBP5(2.13±0.30比0.98±0.34)、SOX9(2.92±0.51比0.94±0.36)和COLⅡmRNA表达水平(6.45±2.81比0.87±0.19)均较高,差异均有统计学意义(t=3.19、5.16、6.27、4.10,均P<0.05);而BAX mRNA表达水平(0.31±0.06比1.02±0.22)较低,差异有统计学意义(t=-11.16,P<0.001)。结论ADAM12基因在大骨节病患者软骨细胞损伤中可能有抑制凋亡和促进分化的作用,其过表达能够使IGFBP3和IGFBP5表达升高。

MMP13和LRP1在大骨节病患者关节软骨细胞自噬功能异常中的作用及机制研究

目的探讨基质金属蛋白酶13(MMP13)和低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)对大骨节病患者关节软骨细胞自噬功能的影响。方法自陕西省地方病防治研究所获取4例大骨节病患者和4例对照受试者的关节软骨样本,采用免疫组织化学(IHC)法检测软骨组织中MMP13和LRP1的表达水平;体外提取并培养软骨细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)法检测软骨细胞LRP1以及自噬相关基因[自噬基因Beclin1(BECN1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)],软骨损伤相关基因[MMP13、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)],软骨细胞分化相关基因[Ⅱ型胶原α1链(COL2A1)、Y染色体性别决定区-盒转录因子9(SOX9)]的mRNA和蛋白表达水平。另提取3例大骨节病患者膝关节样本的软骨细胞,采用RNA干扰(RNAi)技术进行MMP13基因沉默实验,并采用qRT-PCR和WB法检测上述基因mRNA和蛋白表达水平。此外,采用LRP1的拮抗剂受体相关蛋白(RAP)对人正常软骨细胞(C28/I2细胞)中LRP1进行封闭,并采用qRT-PCR和WB法检测软骨细胞LRP1、自噬、分化和软骨损伤相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果IHC结果显示,大骨节病患者软骨组织表、中、深层的MMP13表达水平(1.67±0.21、0.59±0.15、0.51±0.12)均显著高于对照受试者(0.25±0.03、0.26±0.04、0.06±0.01),差异均有统计学意义(t=-11.38,P<0.001;t=-3.82、-6.26,P=0.019、0.003);LRP1表达水平(0.10±0.02、0.03±0.01、0.17±0.03)均显著低于对照受试者(1.63±0.40、0.44±0.12、0.34±0.08),差异均有统计学意义(t=6.61、5.61、3.64,P=0.003、0.005、0.022)。大骨节病患者软骨细胞中MMP13、CASP3、SOX9的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照受试者,差异均有统计学意义(均P<0.05);LRP1、LC3、COL2A1的mRNA表达水平均显著低于对照受试者,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在大骨节病患者软骨细胞中沉默MMP13基因后,LRP1、BECN1、LC3、CASP3、COL2A1和SOX9的mRNA和蛋白表达水平均无显著变化(均P>0.05)。采用RAP封闭LRP1后,软骨细胞LRP1、BECN1、LC3、MMP13、COL2A1和SOX9的蛋白表达水平均明显低于对照组(均P<0.05)。结论MMP13与大骨节病患者关节软骨细胞的自噬异常无直接联系;封闭LRP1后软骨细胞自噬相关基因BECN1、LC3的表达降低。

几种常见真菌毒素脱毒方法的研究进展

真菌毒素是真菌在生长过程中所产生的一些次级代谢产物,广泛存在于谷物和饲料中,对人畜健康危害极大。常见的真菌毒素有:黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、伏马菌素等。真菌毒素的脱毒主要是指破坏、除去以及减少粮食中毒素毒害的收获后处理。在现有的脱毒方法中,物理脱毒方法包括蒸煮、吸附、辐射等,化学脱毒方法包括添加化学物质和杀菌剂等,生物脱毒方法包括微生物吸附和微生物降解等。本文对常见真菌毒素的脱毒方法以及其它最新的脱毒方法进行了综述。

一株小麦内生真菌的鉴定及其发酵产物对兔软骨细胞的影响

本研究对分离自青海大骨节病区小麦籽粒中优势内生真菌6-5-1菌株进行菌种鉴定并探讨其发酵产物对兔膝软骨细胞的影响。通过形态学观察及ITS序列分析进行菌种鉴定;其发酵产物经75%乙醇提取,并将乙醇总提物用3种不同有机溶剂(石油醚,乙酸乙酯和乙醚)进行萃取,分别作用于兔软骨细胞;四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)显色法检测细胞存活率,甲苯胺蓝(toluidine blue,TB)染色法和免疫组化法分别检测蛋白聚糖和胶原蛋白的表达;RT-PCR检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原m RNA的表达。经鉴定6-5-1菌株为三线镰孢霉(Fusarium tricinctum)。其发酵产物乙醇总提物对细胞存活率有较强的抑制作用,对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成与m RNA的表达均有抑制作用;其他萃取分部对软骨细胞损伤程度各不相同,石油醚分部作用最强,且各分部的影响作用均弱于乙醇总提物。可见6-5-1菌株代谢产物中应该有多种对软骨细胞产生损伤的物质,且这些物质可能存在协同作用。石油醚分部中可能存在已知损伤软骨细胞毒素以外的其他物质。

1例干骺端新发大骨节病患者家中自产粮食分离的梨孢镰孢霉菌株代谢产物分析

目的对分离自干骺端新发大骨节病患者家中自产粮食的梨孢镰孢霉菌株进行代谢产物成分分析,为真菌毒素与大骨节病的关系研究提供科学依据。方法梨孢镰孢霉菌株来自于2016年在青海省贵德县的1例干骺端新发大骨节病患者家中自产穗期小麦。将分离梨孢镰孢霉菌株接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中进行增菌培养。分离纯化其发酵的代谢产物,采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)仪检测代谢产物中的真菌毒素,结合网络数据库Metlin进行全谱鉴定。结果该菌株代谢产物经LC-MS检测和Metlin全谱鉴定,存在单端孢霉烯类毒素、伏马菌素(Fumonisin)和玉米赤霉烯酮(ZEA)等真菌毒素。在正离子模式下共检测到1 601个物质特征峰,含量最多的真菌毒素是Fumonisin FP3、A2、FP1;在负离子模式下共检测到1 000个物质特征峰,含量最多的是ZEA和单乙酰氧基镰草镰刀菌醇。结论分离的梨孢镰孢霉菌株代谢产物中主要含有单端孢霉烯类、Fumonisin类和ZEA类3大类真菌毒素。

一株小麦内生链格孢霉代谢产物对兔膝软骨细胞的影响

本研究选择分离自青海大骨节病区小麦麦穗中的一株优势内生链格孢霉,探究其代谢产物对兔软骨细胞的影响。通过显微形态学观察和ITS序列分析鉴定菌种;其代谢产物采用75%乙醇提取,然后依次用石油醚、乙酸乙酯、乙醚萃取;methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide(MTT)法检测兔软骨细胞存活率;反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription and polymerase chain reaction)检测软骨细胞蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达量;甲苯胺蓝染色法(toluidine blue,TB)和免疫组化染色法(immunological histological chemistry,IHC)分别检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。经鉴定实验菌株(编号13-8-A)为互隔链孢霉(Alternaria alternate)。与对照组相比,实验组中的乙醇粗提物能抑制软骨细胞生长,对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达及其mRNA的表达量均有抑制作用;其他萃取分部提取物都能不同程度地损伤软骨细胞,但它们对这两种蛋白的表达及其mRNA表达量的抑制均弱于相同浓度下乙醇粗提物的处理。互隔链孢霉13-8-A代谢产物中应该存在多种可以损伤软骨细胞且可能具有协同作用的物质。

大骨节病与骨性关节炎DNA甲基化衰老时钟的比较研究

目的探讨大骨节病和骨性关节炎的软骨细胞是否存在过早衰老。方法收集大骨节病、骨性关节炎和对照组的膝关节软骨样本各5例,样本均来源于西安交通大学第二附属医院。提取膝关节软骨样本DNA,采用Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片技术对其进行DNA甲基化分析。同时,基于全基因组甲基化数据,利用线上DNA甲基化衰老时钟计算器(https://dnamage.genetics.ucla.edu/home)计算样本的DNA甲基化年龄,并与实际年龄进行比较。结果在大骨节病组与对照组的比较中,发现1212个差异甲基化CpG位点,包括497个高甲基化CpG位点和715个低甲基化CpG位点,分别对应264个高甲基化基因和368个低甲基化基因;在骨性关节炎组与对照组的比较中,发现656个差异甲基化CpG位点,包括343个高甲基化CpG位点和313个低甲基化CpG位点,分别对应177个高甲基化基因和174个低甲基化基因。在上述比较中,检测到367个重叠CpG位点(对应182个基因),这些位点在大骨节病组与对照组以及骨性关节炎组与对照组的比较中均存在差异甲基化表达。DNA甲基化衰老时钟结果表明,大骨节病、骨性关节炎以及对照组DNA甲基化年龄与实际年龄的平均年龄加速度差异分别为2.549、0.017、-5.364岁,大骨节病组和骨性关节炎组DNA甲基化年龄均大于实际年龄。结论大骨节病和骨性关节炎的软骨细胞均存在过早衰老。