人锰超氧化物歧化酶的扩增和表达研究

构建人锰超氧化物歧化酶的原核表达载体,对影响蛋白表达的因素进行探索,并初步检测其活性。以人293T细胞cDNA为模板,利用PCR方法克隆人锰超氧化物歧化酶基因,将其插入pET15b载体中,经测序鉴定正确后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami,通过IPTG诱导,SDS-PAGE检测菌体总蛋白。利用SOD检测试剂盒检测粗提物的SOD活性。结果:PCR扩增了一个长597bp的基因片断,该片断编码由198个氨基酸组成的成熟的人锰超氧化物歧化酶蛋白。经过IPTG诱导表达出约25k的蛋白。优化的IPTG浓度为0.25mmol/L,在1～6h范围内随着诱导时间的增加表达量逐渐增加,IPTG总量一样的情况下分次加入比单次加入所诱导的目的蛋白产量高。SOD活性检测表明经过诱导表达的hMn-SOD具有SOD活性。结论:成功扩增人锰超氧化物歧化酶基因,并构建了原核表达载体,经过IPTG诱导表达的目的蛋白有SOD活性。