基于RNA-Seq技术筛选影响猪肌纤维性状的候选基因

旨在探究影响肌纤维性状的候选基因和信号通路。本研究以马身猪和大白猪为研究对象,采用HE染色法分析6月龄马身猪和大白猪背最长肌肌纤维直径和密度,利用RNA-Seq分析马身猪和大白猪背最长肌组织中基因表达情况,并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,再通过qRT-PCR验证RNA-Seq结果的准确性。结果显示,马身猪背最长肌肌纤维直径极显著低于大白猪(P<0.01),而肌纤维密度极显著高于大白猪(P<0.01)。转录组测序结果显示,在6月龄马身猪和大白猪背最长肌中,差异倍数在2倍以上的基因共105个,其中,马身猪相对于大白猪上调的基因有55个,下调的基因有50个。GO富集分析表明,差异表达基因主要富集在与线粒体相关的细胞组分和骨骼肌分化有关的生物学过程中;KEGG分析结果显示,这些差异表达基因主要参与到与氧化磷酸化有关的信号途径。qRT-PCR和RNA-Seq对6个DEGs表达情况的检测结果表明它们的表达趋势相同,说明RNA-Seq结果准确可靠。结合差异基因表达丰度、GO和KEGG富集分析结果,本研究发现,MYL3、MYH3、MYH6基因通过影响肌纤维的组成而影响肌纤维特性,ND6基因通过参与线粒体氧化磷酸化过程影响肌纤维类型,MICU2基因通过维持线粒体Ca^(2+)浓度的稳态影响细胞功能,编码转录因子的EGR1和FOS基因通过调节细胞增殖、分化和凋亡等过程影响肌肉生长发育。本研究初步揭示了造成马身猪和大白猪肌纤维性状差异的主要原因,为猪肉品质的改善提供了相应的理论依据。

猪肌源性前体脂肪细胞的分离培养和成脂诱导分化研究

本研究旨在建立猪肌源性前体脂肪细胞的体外培养体系,并探究成脂诱导分化过程中相关基因的表达,为进一步研究调控猪肌内脂肪沉积的分子机制提供试验材料。采集15日龄仔猪的背最长肌组织,使用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离获得前体脂肪细胞,进行原代、传代培养以及成脂诱导,观察细胞形态、测定生长曲线、油红O染色鉴定以及检测成脂关键基因PPARγ、FABP4、C/EBPα、C/EBPβ、ZFP423、SREBP1、PRDM16和HSL在诱导分化过程中的表达量。结果表明,分离的猪肌源性前体脂肪细胞在6～7 h,发现少量细胞开始贴壁,贴壁的细胞呈似圆型、小梭型以及其它不规则形状,经传代后细胞形态均一,呈典型的成纤维细胞样,细胞的生长曲线呈S型。添加分化培养基进行诱导后,所有基因在细胞分化的早期均有表达,FABP4、C/EBPα、SREBP1与PPARγ基因在分化早期表达量极显著升高(P <0. 01),在后期表达量极显著下降(P <0. 01),C/EBPβ、ZFP423和PRMD16基因的表达量在分化过程中未见显著变化,HSL的表达量随着分化进行极显著降低(P <0. 01)。在诱导分化12 d左右,油红O染色呈现红色。综上表明,本研究成功建立了猪肌源性前体脂肪细胞的分离与培养体系,进行成脂诱导分化,揭示分化过程中关键基因的表达规律,为进一步研究猪肌内脂肪沉积的分子机制和改善肉质品质奠定基础。

马身猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养与鉴定

为研究马身猪体细胞的生物学特性,试验以3日龄马身猪耳缘组织为材料,采用组织块贴壁法建立马身猪耳缘组织成纤维细胞系,并对体外获得的细胞系进行生物学特性检测。结果表明,获得的马身猪耳缘组织成纤维细胞系符合成纤维细胞的基本特征,细胞贴壁生长,呈典型的梭形、星形和多边形,细胞汇合成单层的时间为10~13d,生长曲线呈S型,中期染色体二倍体(2n=38)占主体,约占细胞总数的84%,符合细胞建系的要求;脂质体(Lipofectamine^(TM)2000)转染绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)的转染效率为25%。马身猪耳缘组织成纤维细胞系的成功建立为地方猪种遗传资源的保护开辟了新的方法。

广灵驴成纤维细胞系的建立及其相关生物学特性研究

试验旨在建立广灵驴成纤维细胞库,以期在细胞水平上对广灵驴进行保护。本研究以1月龄广灵驴耳缘皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行成纤维细胞培养,建立了广灵驴耳缘皮肤组织成纤维细胞系,并对其相关生物学特性进行了鉴定。结果发现,试验所建立的广灵驴成纤维细胞系大多数细胞呈长梭形,部分细胞呈三角状或星型。在培养过程中,广灵驴原代成纤维细胞在贴壁4d时开始有细胞从组织边缘游离出来,贴壁14d后,细胞汇合率达到80%,可以进行第一次传代培养;细胞生长态势良好,生长曲线呈典型的S型曲线;细胞冻存复苏后活率有所下降,但生长状态良好。细胞分裂中期染色体数2n=62,说明成功建立了广灵驴成纤维细胞系。通过本方法建立的广灵驴成纤维细胞系为后续广灵驴的相关研究奠定了基础。

不同猪种ADIPOQ基因外显子2多态性及其与山西白猪体重和体尺性状的关联分析

本研究旨在检测猪脂联素(adiponectin,ADIPOQ)基因外显子2的多态性,并分析其对山西白猪体重和体尺性状的影响。采用PCR-SSCP技术检测了长白猪、大白猪、杜洛克猪、山西白猪、山西黑猪和马身猪6个猪种392个个体ADIPOQ基因外显子2的多态性,并采用GLM程序分析了ADIPOQ基因外显子2多态性与山西白猪体重和体尺性状的关联性。结果显示,在ADIPOQ基因外显子2的89bp处检测到G→A错义突变,引起缬氨酸(Val)向异亮氨酸(Ile)的转变。ADIPOQ基因外显子2存在3种基因型:AA、AB、BB,2个等位基因:A和B。杜洛克猪中只有BB基因型,长白猪、大白猪、山西白猪和山西黑猪中BB基因型为优势基因型,马身猪中AA基因型频率最高。在引入品种长白猪、大白猪和杜洛克猪中B等位基因为优势等位基因,基因频率分别为0.96、0.96和1.00;在地方品种马身猪中A等位基因频率(0.52)略高于B等位基因(0.48);在培育品种山西白猪和山西黑猪中B等位基因频率分别为0.76和0.78,介于引入猪种和地方品种之间。基因型频率分布在马身猪、山西白猪和山西黑猪之间无显著差异(P>0.05),杜洛克猪与长白猪、大白猪间差异均不显著(P>0.05),而长白猪和大白猪间差异显著(P<0.05),任意一个引入品种与马身猪、山西白猪和山西黑猪之间的差异均达到极显著水平(P<0.01)。ADIPOQ基因外显子2多态性对断奶重有显著影响,其中BB基因型个体28日龄断奶重显著高于AA和AB基因型(P<0.05),AA和AB基因型间无显著差异(P>0.05),但对其他性状无显著影响,说明该位点只在个体发育早期阶段起作用。

猪MYNN基因可变剪接体的克隆及表达特性研究

旨在克隆猪MYNN基因的可变剪接体,并预测编码蛋白的结构与功能,研究各转录本的时空表达特性。本研究以马身猪为试验动物,采用RT-PCR技术对猪MYNN基因全长CDS区进行克隆,并采用生物信息学技术分析其编码蛋白的生物学特性;在心、肝、脾、肺、肾、小脑、小肠、胰、胃、肌肉和脂肪组织中,采用实时荧光定量PCR技术对MYNN基因的表达谱进行研究,并在胃和肌肉组织中进行发育性表达规律的研究。结果表明,本研究成功克隆出猪MYNN基因的两个转录本MYNN-1(GenBank登录号:KY470829)和MYNN-2(GenBank登录号:KY670835)。MYNN-1的CDS区全长1 830bp,编码609个氨基酸,编码的蛋白质属于碱性可溶性稳定蛋白质;MYNN-2的CDS区全长1 746bp,编码581个氨基酸,编码的蛋白质属于碱性可溶性不稳定蛋白质;与MYNN-1相比,MYNN-2少了84bp,缺失第6外显子,且通过功能结构域预测发现,MYNN-2比MYNN-1少一个C2H2类型的锌指蛋白结构域;同源性及进化树分析发现,猪MYNN基因的两个转录本所编码的氨基酸序列与北极熊、山羊、马、家犬等物种的同源性较高,遗传距离较近,说明MYNN基因在进化过程中十分保守。MYNN-1和MYNN-2在马身猪的各个组织中均有表达,且各组织之间表达差异显著(P<0.05);在马身猪胃、小肠和胰中高表达,脂肪组织中表达量最低。在各组织(除肾)中MYNN-1的表达量均显著或极显著高于MYNN-2(P<0.05;P<0.01),说明MYNN-1为主要亚型;随着日龄的增加,MYNN-1和MYNN-2在胃中的表达量均呈现逐渐降低的趋势,在背最长肌中,呈现先上升后下降的趋势。本试验成功克隆了猪MYNN基因的两个可变剪接体,并推测MYNN在猪的消化吸收以及骨骼肌的生长发育过程中有重要作用,但其作用的具体机制还需进一步研究。

MYNN基因在猪不同组织及肌肉中的表达规律

试验旨在研究myoneurin(MYNN)基因在猪不同组织中的表达特征及其在肌肉(背最长肌、股二头肌和腰大肌)、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR技术研究猪MYNN mRNA在90日龄大白猪和马身猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小脑、小肠、胰脏、胃、股二头肌及脂肪共11个组织中的表达谱,以及在大白猪和马身猪1、90、180日龄3个发育阶段的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。结果表明,MYNN在猪的各种组织中广泛表达,且各组织间表达差异显著或极显著(P<0.05;P<0.01);MYNN在大白猪和马身猪的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的不同发育阶段表达差异显著或极显著(P<0.05;P<0.01),并具有特定规律,由此推测其可能在猪的这几种组织中发挥重要作用。MYNN基因的表达与组织、日龄及品种的遗传背景有关。本试验为研究猪MYNN基因的生物学功能提供了依据,但还需要深入的研究来探索其作用的具体机制,尤其是在骨骼肌发育中的调节机制。

不同月龄马身猪和大白猪血清生长激素及其受体的变化规律

试验旨在探讨马身猪和大白猪血清中生长激素（growth hormone,GH）及其受体（growth hormone receptor,GHR）在生长发育过程中的变化规律,采用ELISA方法检测马身猪和大白猪0～6月龄血清中GH和GHR的浓度。结果表明,马身猪和大白猪在0～6月龄血清中GH浓度变化趋势基本相似,随着日龄的增长,血清中GH浓度呈逐渐上升的趋势,分别在4和5月龄时达到最高值,随后又逐渐降低,但与峰值无显著差异（P〉0.05）,在3和4月龄时,马身猪血清中GH浓度略高于大白猪,而在其他月龄,大白猪血清中GH均高于马身猪;0～6月龄,马身猪血清中GHR浓度无显著差异（P〉0.05）,大白猪血清中GHR的含量在1月龄时最低,与4月龄差异极显著（P〈0.01）,与6月龄差异显著（P〈0.05）,其他月龄间差异不显著（P〉0.05）,0～2月龄,马身猪血清中GHR含量高于大白猪,但只有在1月龄时差异达极显著水平（P〈0.01）;3～6月龄,大白猪血清中GHR含量高于马身猪,且在4和6月龄时差异显著（P〈0.05）,5月龄时差异极显著（P〈0.01）。血清中GH和GHR浓度与猪的发育阶段和遗传背景有关,其变化规律与猪生长速度的变化趋势相一致。

马身猪MEF2A基因4种可变剪接体的克隆和生物信息学分析

本研究旨在克隆马身猪肌细胞增强因子2A(myocyte enhancer factor 2A,MEF2A)基因的不同剪接体类型。依据转录组测序对可变剪接的预测结果,试验扩增MEF2A基因第5~8外显子之间的编码区,用生物信息学软件分析了马身猪MEF2A基因不同剪接体的序列特性,预测保守结构域,构建系统进化树,比对不同物种MEF2A的氨基酸同源性。结果显示,获得了4个MEF2A基因的剪接体,MEF2A1的第5~8外显子正常剪接;MEF2A2缺失了第5外显子,第6外显子的5′端多出138bp,第7外显子的3′端多出102bp;MEF2A3缺失了第5外显子,第6外显子的5′端多出138bp;MEF2A4第7外显子的3′端多出102bp。插入的138bp序列编码的蛋白质中存在1个保守结构域HJURP_C,这可能与MEF2A参与肝细胞纤维化作用有关。MEF2A1和MEF2A4与猪MEF2A1(GenBank登录号:NP_001090890.1)同属于一个亚群,同源性高达98.9%,MEF2A2和MEF2A3与猪MEF2A2(GenBank登录号:NP_001093168.1)同属于一个亚群,同源性分别为98.2%和98.9%。本试验成功克隆了4个MEF2A基因的剪接体,为进一步研究其蛋白功能奠定基础。

流产布鲁菌LysR家族转录调控子LTTR8缺失株的构建及其生物学特性分析

布鲁菌是一种重要的人畜共患病病原,兼性胞内寄生,无典型毒力因子,毒力相关基因的研究对阐明布鲁菌持续感染的机制具有重要意义。本研究以流产布鲁菌S2308为亲本株,通过同源重组的方法,构建流产布鲁菌LysR家族转录调控子基因bab_RS24670缺失株ΔlttR8,基于广宿主质粒pBBR1MCS构建成互补株ΔlttR8-Com。免疫印迹试验表明:ΔlttR8为光滑型菌株;体外培养分析发现lttR8缺失不影响布鲁菌的生长;细胞感染试验发现lttR8缺失不影响布鲁菌黏附、入侵细胞和胞内存活的能力。耐受性试验分析发现:lttR8缺失不影响布鲁菌对过氧化氢(H2O2)和多粘菌素B(polymyxin B)的敏感性。小鼠感染试验分析发现lttR8缺失显著减弱流产布鲁菌的毒力。综上所述,本研究发现一个新的与流产布鲁菌致病性相关的转录调控子,为布鲁菌致病机制研究提供参考。

DNA甲基化与去甲基化调控脂肪沉积的研究进展

脂肪沉积是一个复杂的生物学过程,受遗传和表观遗传的调控作用。DNA甲基化和去甲基化是表观遗传修饰的重要方式,可通过与转录因子的相互作用或改变染色质的结构调控基因的表达,进而参与机体生长发育和细胞分化等重要的生命过程。动物脂肪沉积是脂肪细胞增殖分化和肥大的结果,脂肪细胞分化是由多能干细胞经前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞转化的过程。相关研究表明,转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxi-some proliferator activiated receptorγ,PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白家族(CCAAT enchancer binding proteinfamily,CEBPs)在脂肪沉积过程中起关键调控作用。近期研究发现,DNA甲基化可以通过调控脂肪形成过程中相关基因的表达而参与脂肪细胞的分化和脂肪组织的生长发育。去甲基化也可影响动物脂肪沉积过程,但其具体机制目前尚不清楚。作者主要介绍了DNA甲基化和去甲基化的定义、发生位点、生物学功能、参与DNA甲基化和去甲基化过程中的酶及其作用机制,概述了脂肪沉积过程及PPARγ、C/EBPα等转录因子在脂肪沉积过程中的调控作用,重点阐述了DNA甲基化和去甲基化对脂肪形成相关基因的表达和对脂肪细胞分化的影响,旨在为阐明脂肪沉积机制及改善动物肉质品质提供参考。

猪CAⅢ基因CDS区克隆、生物信息学及组织表达分析

对猪碳酸酐酶Ⅲ(Carbonic anhydrase Ⅲ,CAⅢ)基因进行克隆及生物信息学分析,并分析该基因的时空表达特性。通过RT-PCR和克隆测序技术获得猪CAⅢ基因的CDS序列,综合利用多种生物信息学软件,对该基因编码的蛋白质生物学特性进行预测,采用qRT-PCR技术检测CAⅢ基因的组织表达谱和时序表达规律。结果表明,猪CAⅢ基因CDS区长783bp,编码260个氨基酸;CAⅢ蛋白为亲水性碱性蛋白,无信号肽,主要在细胞质中发挥作用;CAⅢ基因在心脏、肝脏、胰脏、肺、胃、背最长肌、皮下脂肪、脾脏、盲肠等9种组织中均有表达,但在背最长肌中表达量最高,极显著地高于其他组织。从初生到5月龄,大白猪背最长肌中CAⅢ基因mRNA表达量呈上升—下降—上升—下降的趋势,初生时最低,随后表达量逐渐升高,到3月龄时达到峰值,之后开始下降;马身猪中,从初生到5月龄,CAⅢ基因mRNA的表达量基本呈上升趋势,在5月龄时达到峰值,极显著地高于其他各个阶段。2个不同品种相比,3月龄和4月龄时,大白猪CAⅢmRNA表达量显著或极显著地高于马身猪;而在5月龄时,马身猪CAⅢmRNA表达量极显著地高于大白猪,其他阶段2个品种CAⅢmRNA表达量无显著差异。CAⅢ基因可能直接或间接参与猪骨骼肌的生长发育过程。

猪CCAR1基因细胞定位、表达特性及对细胞增殖的影响

旨在获得猪CCAR1基因的完整CDS序列,研究其亚细胞定位和表达特性,探究其对细胞增殖的影响和作用机制。本研究以1日龄马身猪肾组织cDNA为模板,采用RT-PCR技术分段扩增猪CCAR1基因的CDS区,通过测序和序列拼接获得完整CDS区;采用细胞免疫荧光技术检测CCAR1在PK15细胞中的定位;采用qRT-PCR技术检测猪CCAR1基因的时空表达规律;采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除PK15细胞的CCAR1基因,通过qRT-PCR、Western blot以及CCK8(cell counting kit 8)技术检测CCAR1基因敲除对细胞增殖能力及细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。结果表明,猪CCAR1基因的完整CDS区长3459 bp(MH301308.1),在PK15细胞的细胞质和细胞核中均有表达。大白猪和马身猪不同组织CCAR1的表达谱基本相似,在所检测的组织中均有表达,均表现为在肾和小肠中表达量最高,在脾、肝、小脑和肌肉中呈中度表达,在心和皮下脂肪中低表达;CCAR1基因在大白猪和马身猪初生、3月龄和6月龄3个年龄阶段的两种骨骼肌中也均有表达。CRISPR/Cas9基因编辑系统能有效降低CCAR1的表达,在转染48 h后,相比于对照组,试验组都对细胞增殖产生极显著抑制(P<0.01);CCAR1基因敲除后,细胞增殖标记基因Mki67表达水平显著下降(P<0.05),Wnt通路下游靶基因C-myc表达量显著下降(P<0.05),Wnt通路核心蛋白β-catenin和凋亡标记基因Caspase3的表达量无显著差异。CCAR1基因在猪不同组织和不同发育阶段均有表达,可能通过调控细胞增殖基因Mki67和Wnt通路下游靶基因C-myc的表达而影响细胞增殖,在猪的生长发育过程中起重要作用。

2012年门诊处方点评与分析

目的:了解我院门诊处方情况,促进临床合理用药。方法:随机抽查2012年门诊处方1 800张,依据《处方管理办法》、《医院处方点评管理规范(试行)》采取回顾性点评、分析。结果:抗菌药物和注射剂使用率均较高,不合理用药现象突出;基本药物使用率则完全符合规定,完全执行了国家基本药物相关政策。结论:我院门诊处方存有不合理用药现象,需加强干预,规范处方质量,保证临床用药安全、有效。

UV法测定更昔洛韦眼用凝胶中间体含量

更昔洛韦眼用凝胶剂是湖北丽益医药科技有限公司研制的新药品种,该药物用于治疗单纯性疱疹病毒I型（HSV-I）引起的单纯性疱疹病毒性角膜炎（HSK）。现行国家标准采用反相高效液相色谱法测定其含量,该法具有检验结果非常准确的优点,但同时存在检验周期较长。

紫外分光光度法测定盐酸氨溴索口服液的含量

盐酸氨溴索是新一代的祛痰药,具有促进粘液排出、溶解分泌物的特性,能有效改善肺功能。现行国家标准采用高效液相色谱法测定其含量。我们考虑到采用高效液相色谱法所使用的设备和试剂的成本均高,检测周期也较长,大多数基层单位也不具备测定条件,故研究了紫外分光光度法对其含量进行了测定。结果显示该方法准确度和精密度均较高，操作快速，简单易行，便于掌握。现报告如下。

RP-HPLC法测定更昔洛韦口腔崩解片的含量

目的：建立反相高效液相色谱法测定更昔洛韦口腔崩解片含量的方法。方法色谱柱VP-ODS C18（4.6mm ×250mm），以甲醇-水（85∶15）为流动相，检测波长254nm，流速1.0mL· min -1。柱温：室温，进样量：20μL。结果更昔洛韦的线性范围为0.02～0.18mg· mL -1（r ＝0.9995）；平均回收率为99.6％，RSD＝0.5％（n＝9）。结论该方法定量准确、灵敏度高、专属性强，可用于更昔洛韦口腔崩解片的含量测定。

臭椿高主干壮苗培育技术

介绍了培育臭椿高主干壮苗的方法,该方法不同于一般的臭椿育苗法,即在重视土、肥、水科学管理的基础上,还需采取截根、平茬、修剪的组合技术。

苗木供求平衡是林业可持续发展的基石

总结了多年来全省历次苗木供求失衡的教训,分析了产生矛盾的深层原因,提出了解决问题的基本对策和办法。