安丝菌素产生菌拟诺卡氏菌EGI80425接合转移体系的建立与应用

安丝菌素是一种有强抗肿瘤作用的天然产物,拟诺卡氏菌Nocardiopsis ansamitocini EGI80425作为安丝菌素的产生菌具有重要的研究价值,因此需要建立其遗传操作体系,并实施对该菌株的遗传改造。首先,通过优化菌丝体接合转移相关的培养时间、供受体比例和培养基中Mg2+浓度等,建立了效率为6.6×10^-3的整合型载体p IB139的接合转移方法;然后在此基础上进一步调整相关条件,建立了效率为6.2×10^-4的游离型质粒p JTU1278的接合转移方法;最后,利用游离型质粒对潜在的PKS竞争基因簇ClusterⅠ和ClusterⅦ进行了缺失。结果显示,ClusterⅠ缺失突变株CXY01中安丝菌素的产量为12.6 mg/L,相比野生型提高了95.3%;ClusterⅦ缺失突变株CXY02中安丝菌素产量为7.4 mg/L,相比野生型提高了15.2%。本研究建立了N. ansamitocini EGI80425的遗传操作体系,并在此基础上对该菌进行了基因组片段敲除,有效提升了安丝菌素产量,为利用N. ansamitocini大量产生安丝菌素奠定了基础。

基于ARTP诱变的安丝菌素P-3高产菌株高通量筛选

美登素家族的安丝菌素P-3(ansamitocin,AP-3)属于大环内酰胺类抗生素,有极强的抗肿瘤活性。鉴于其重要的药用价值和广阔的市场前景,提高AP-3的产量成为国内外研究重点。本研究采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术,并结合24深孔板发酵及以线黑粉酵母(Filobasidium uniguttulatum)为指示菌的高通量生物测定筛选技术,最终筛选到两株AP-3产量稳定提高15%的珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的突变株——M13和M144。并对高通量生测筛选技术进行了优化,最终确定实验过程的最佳参数:在液体摇瓶YPD中培养15 h时线黑粉酵母指示菌株可达到对数生长中期,且当摇瓶转接至孔板的接种量为10%时,指示菌与AP-3混合培养至30 h达到稳定期,可以明显观察到指示菌在0.2~0.7μg/mL AP-3浓度范围内的线性生长变化,酶标仪OD_(600)读数与AP-3浓度之间的标准曲线为y=0.0228x+1.8377,R^(2)=0.9906。以AP-3产量提高15%作为筛选指标,可筛选出高产突变株。对经高通量生测筛选出的突变株经10轮传代发酵后,最终筛选出两株AP-3产量稳定提高的突变株M13和M144。经二代重测序后,可定位突变株内部的突变位点,为今后从全基因组层面解析AP-3的高产原因,以及建立珍贵束丝放线菌ATCC31280的代谢网络提供理论基础。