固氮模块在耐辐射异常球菌底盘中的表达特性分析

利用生物技术方法将固氮模块转入真核细胞实现真核生物自主固氮具有重大科学意义和应用价值,迄今为止始终未能获得具有自主固氮能力的真核生物。为了探究固氮模块在真核底盘中的表达适配性,以进化地位介于原核生物和真核生物之间的极端微生物耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1为底盘,将类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)WLY78的固氮模块导入耐辐射异常球菌中获得重组耐辐射异常球菌R78,并利用qPCR(quantitative real-time PCR)和Western Blot等方法,同时结合转录组分析,对重组耐辐射异常球菌的表达特性进行探究。结果表明,重组耐辐射异常球菌固氮模块中的9个固氮基因均能够正常转录,但是固氮酶铁蛋白的翻译受到影响;转录组测序结果显示,参与能量传递、氮代谢以及铁硫转运的相关基因的表达变化可能是影响重组菌株中固氮酶表达的限制因子。以上研究结果为进一步的固氮模块设计和微生物底盘优化,并最终构建人工高效固氮装置奠定了理论基础。

非编码RNAs在细菌代谢网络调控中的研究进展

非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)是一类非常重要的调节子,此类调节子能够使细胞通过调节它们的生理特性而适应环境的改变。已有的研究表明ncRNAs在细菌的蔗糖代谢、细胞外膜应激反应、群体感应和细菌毒力等方面发挥了重要的调节作用,其调控模式已经成为细菌调控网络中的重要"分支"。本文综述了细菌ncRNAs近年来的研究进展,详细介绍了细菌ncRNAs的合成及调控机制,由于ncRNAs结构的独特性及调控网络的复杂性,因此ncRNAs的功能研究已经成为近几点的研究热点之一。

非生物胁迫条件下施氏假单胞菌生物膜形成规律的研究

旨在系统研究非生物胁迫因素对固氮施氏假单胞菌A1501生物膜形成能力的影响,测定了不同NaCl浓度、pH值、温度等培养条件下A1501生长及其生物膜形成能力的变化规律。结果显示,上述3种环境因素均对A1501菌的生长及生物膜形成具有影响,且呈现出一定的规律性。NaCl浓度2 mmol/L、p H值6.8、温度30℃是A1501的最适生长条件,而在0.6 mol/L的NaCl、p H值6.0及温度40℃等胁迫条件下,A1501菌的生物膜形成量均达到最高,分别为最佳生长条件下的7.8、7.0和2.0倍。在测试的诸因素中,NaCl浓度对A1501生物膜形成影响最大。以上结果表明,生物膜的形成与菌体生长负相关,即高盐、弱酸、高温等条件不利于A1501的生长,但刺激了其生物膜的形成。

一般氮代谢调控蛋白NtrC的研究进展

NtrBC是细菌氮代谢调控系统中双组分系统,其中NtrC是响应环境信号的转录激活蛋白,对靶基因具有转录激活作用。已有的研究表明NtrC在细菌氮源利用、生物固氮、高分子胞外聚合物合成、碳氮平衡等方面发挥了重要的调节作用。对NtrC的全局调控作用研究,是当前微生物代谢调控网络研究热点之一。综述了细菌NtrC近年来的研究进展,详细介绍了细菌NtrC的生物学功能及调控机制,以期为更好地了解微生物的环境适应性,代谢多样性和碳氮偶联作用的分子机制奠定理论基础。

醋酸钙不动杆菌PHEA-2苯酚降解调控蛋白MphR化学信号域的研究

MphR是醋酸钙不动杆菌PHEA-2调控苯酚代谢的激活蛋白。通过分析苯酚羟化酶启动子的lacZ融合子(PmphK::lacZ)在21种苯酚及苯酚衍生物诱导时的β-半乳糖苷酶活性,确定了调控蛋白MphR化学信号域可以识别苯酚,邻甲酚,间甲酚,邻氯苯酚等酚类衍生物。大肠杆菌中逐段截短MphR化学信号域试验证实,当化学信号域截短后,MphR受苯酚诱导激活转录的功能丧失。结果表明,化学信号域对于苯酚激活转录功能极为重要。

假单胞菌中影响碳代谢的三种途径及其调控机制

当环境中存在多种生长介质时,微生物会利用自身的代谢调控系统优先选择最适碳源达到最佳的生长,同时抑制非优势碳源的利用,这种现象叫做碳代谢抑制。目前已知有CbrAB/Crc、CyoABCDE及PTSNtr三个系统参与假单胞菌中碳代谢抑制调控。其中CbrAB/Crc系统由双组份CbrA/CbrB、非编码sRNA以及RNA结合蛋白Crc组成,通过自由Crc的水平来调控非优势碳源代谢基因的转录。CyoABCDE系统由一些末端氧化酶构成,通过电子转移来调控非优势碳源代谢基因的表达。PTSNtr系统由PtsP、PtsO及PtsN三种蛋白组成,通过系统的磷酸化激活PtsN从而对代谢基因进行调控。本文将详细介绍了假单胞菌中三种碳代谢抑制调控系统的作用机制。

固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501同化硝酸盐代谢基因簇分布及调控研究

固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501在有氧条件下能够利用硝酸盐/亚硝酸盐为唯一氮源生长,表明该菌除了具有固氮和反硝化等氮循环系统外还有同化硝酸盐/亚硝酸盐系统。为进一步阐明该菌同化硝酸盐的代谢机制,利用生物信息学手段分析了硝酸盐同化相关基因的组成及分布情况,并初步研究了同化硝酸盐途径特异性调控关系。结果表明,P.stutzeri A1501中存在两个硝酸盐同化基因簇nasST-nasA-nirBDnasBcobA和nasR-nasFED,分布于基因组不同部位。第一个基因簇中nasS-nasT编码二元抗转录终止因子,nasA编码NarK/NasA家族硝酸盐转运蛋白,nirBD编码亚硝酸盐还原酶,nasB编码同化硝酸盐还原酶,cobA编码参与西罗血红素合成的尿卟啉-ⅢC-甲基转移酶;第二个基因簇中nasR编码单一组分抗转录终止因子,nasFED编码ABC型(ATP依赖)硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白。NasS-NasT双组分蛋白调控硝酸盐/亚硝酸盐还原酶基因的转录,NasR调控硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白基因的转录。

苯酚羟化酶的功能与调控研究进展

苯酚是一种广泛存在的芳香烃污染物,可以被一些环境微生物降解。苯酚好氧降解的第一步是苯酚被苯酚羟化酶催化为邻苯二酚。苯酚羟化酶的转录主要由XylR/DmpR调控蛋白激活,另外在一些多组分苯酚羟化酶操纵子中也发现了起抑制作用的调控蛋白。综述了苯酚降解菌中苯酚羟化酶的功能和调控机制等方面的研究进展。

细菌感应金属信号及调节金属稳态的研究进展

铁、锰、锌等微量金属元素是几乎所有细菌生存所必需的,在各种关键代谢过程中起着重要的辅助因子作用。例如,铁缺乏的条件下细菌很难维持正常的生理活动,但是过量的铁也会通过Fenton反应催化活性氧物质(如羟基自由基)的形成从而对细菌造成损伤。针对环境中不断变化的金属离子可用性,结合内环境的变化,细菌进化出了以各金属离子吸收调节家族蛋白为核心的多种调控机制。这些调控元件大多是将基因调控与金属浓度相偶联的全局性转录因子家族,也是细菌金属代谢中最重要的调节因子。以细菌的铁稳态为例介绍了调控金属离子稳态的经典模式,同时对不同内外环境条件下的铁平衡和铁运输进行了详细介绍;以几种典型金属元素的胞内稳态为例介绍了目前三种已知金属感应调节器的类型,为细菌的某些未知金属稳态及其他微生物的金属传感器及金属稳态的研究提供了参考。

大肠杆菌氮代谢调节蛋白GlnG与固氮施氏假单胞菌氮代谢调节蛋白NtrC的功能互补研究

旨在围绕大肠杆菌DH10B(Escherichia coli DH10B)中氮代谢调节蛋白GlnG与施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeriA1501)中氮代谢调节蛋白NtrC在一般氮代谢调控网络中是否存在功能互补展开研究。利用DH10B菌的glnG基因回补A1501菌的ntrC突变株,以及A1501菌的ntrC基因回补DH10B菌的glnG突变株,对所获得的功能互补株分别展开生理生化表型测定。结果表明,在以硝酸钾或尿素为唯一氮源的培养条件下,DH10B glnG基因可以回补A1501ntrC突变株的氮源利用能力,并且部分恢复ntrC突变株的固氮酶活性(约为野生型A1501固氮酶活性的45%);与DH10B glnG突变株相比,A1501菌的ntrC基因回补了DH10B glnG突变株以精氨酸为唯一氮源的生长能力。以上结果说明DH10B菌的GlnG蛋白与A1501菌的NtrC蛋白不仅在进化关系上紧密联系而且在所测试的氮代谢途径中存在功能互补。

施氏假单胞菌A1501铁吸收调节蛋白Fur的表达特性与功能鉴定

铁是细胞生理代谢的重要金属元素,是多种氧化还原酶类、过氧化物酶类的重要组成部分。革兰氏阴性菌中,胞内铁转运、储存和利用主要由铁吸收调节蛋白Fur(ferric uptake regulator)调控。水稻根际联合固氮菌--施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501基因组中含有一个fur同源基因,但其具体功能尚不清楚。比较了A1501中fur基因及其编码蛋白的序列特征,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative,qRT-PCR)和Western blotting杂交方法测定了fur基因和Fur蛋白的表达特性,结果发现fur基因表达水平与环境中铁浓度呈负相关,在铁限制条件下高表达,铁过量条件下表达受抑制。构建了fur基因突变株和功能回补株,表型测定发现fur突变影响了A1501的碳源代谢谱,并导致A1501对过氧化氢胁迫敏感。胞内铁含量测定表明,fur突变株内的铁含量为野生型的1.3倍,进一步qRT-PCR测定表明fur突变影响了铁离子转运系统及过氧化物酶编码基因的表达。研究结果为解析根际微生物胞内铁平衡调节及根际环境适应机制奠定了理论基础。

施氏假单胞菌氮代谢调控蛋白GlnK与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作研究

细菌中PⅡ蛋白是一类氮代谢调控因子,可通过感知胞内碳氮信号变化调整自身与靶蛋白的相互作用,从而实现对下游基因的级联调控。α-酮戊二酸是胞内碳状态的重要信号分子,前期研究发现PⅡ蛋白可结合α-酮戊二酸感应细胞内的碳状态,但不同菌中二者的结合存在差异。施氏假单胞菌A1501(Pseudomononas stutzeri A1501)只含有1种PⅡ蛋白GlnK,其在A1501固氮调控中发挥重要作用,但具体碳信号感知与转导机制有待进一步探索。基于此,通过大肠杆菌外源表达GlnK蛋白,并通过微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)方法研究GlnK蛋白与碳信号分子α-酮戊二酸的体外互作,发现二者可以体外结合,且进一步证实GlnK蛋白的第89位甘氨酸(G89,Gly89)可能与互作相关。研究结果为进一步解析α-酮戊二酸在A1501中的信号转导奠定了基础,也为深入解析固氮菌的碳氮代谢偶联机制提供了理论支持。

细菌全局性调控因子CsrA功能及其作用机制研究进展

CsrA最初在研究碳储存调节系统(carbon storage regulation system)时被发现并被命名,是一个在肠杆菌、假单胞菌及芽孢杆菌等微生物中广泛存在的转录后调节因子,它可通过与靶标基因mRNA结合进而影响其稳定性或者抑制mRNA的翻译最终影响靶基因的表达。研究表明,CsrA属全局调控因子,不仅参与细菌的中心碳代谢、运动、生物膜形成、群体感应、致病性等多种生命活动,而且也参与了细菌多种次级代谢物的合成,具有重要的生物学意义。最近的研究表明,CsrA功能的实现与两个非编码调控RNA具有重要关联,它们组成了复杂而精细的调控单元。综述了不同微生物中CsrA功能的多样性,并阐述了CsrA参与分子调控的机制,对于深入认识碳储存系统的调控机制以及针对性的改造和利用该系统具有重要的理论意义。

固氮施氏假单胞菌全局性调控因子RsmA的进化分析及表达特性研究

RsmA是假单胞菌属高度保守的全局性调控因子,该蛋白可通过与靶基因的mRNA结合影响其稳定性或者抑制靶基因的翻译影响蛋白表达。固氮施氏假单胞菌A1501中发现一个rsmA同源基因及一个可能参与rsmA活性调节的非编码小RNA rsmZ基因。对A1501菌中RsmA及RsmZ的分子进化及表达特性进行了研究。分析结果表明,RsmA与铜绿假单胞菌同源性可达98%,RsmZ具有4个RsmA的结合位点。实时定量RT-PCR结果显示,rsmA在生长初期具有高表达量,而在指数生长期以及平台稳定期表达量下降。非编码RNA rsmZ的转录水平在整个生长时期未发生显著变化。在碳匮乏条件下,rsmA和rsmZ的表达量都显著下调。在一般胁迫σ因子rpoS突变株中,rsmA的表达未受影响,但rsmZ表达上调了30多倍,说明rsmZ的表达受rpoS的负调控。进一步发现,A1501菌中,rsmA和rsmZ的转录不受转录调控因子gacA突变的影响,这与荧光假单胞菌CHAO和铜绿假单胞菌PAO1的调控模式区别,表明RsmA的转录调控模式在固氮施氏假单胞菌A1501中有其独特性。该结果为进一步探索固氮施氏假单胞中RsmA的功能及其特定条件下的调控机制奠定了理论基础。

假单胞菌碳代谢抑制调控系统各组分的功能及作用机制

在复杂的生存环境中,微生物通过碳代谢抑制作用(CCR)优先利用优势碳源,同时抑制非优势碳源的使用,进而达到最佳的生长和代谢过程。碳代谢抑制调控在细菌中普遍存在,但在不同物种间存有差异。大肠杆菌中以CRP蛋白为核心,而假单胞菌的碳代谢抑制调控以CbrAB-CrcZ-Crc为核心发挥作用,其中Crc蛋白是一个全局性的调控因子,CrcZ是一个新发现的非编码调控RNA,二元调控系统CbrAB控制CrcZ的表达,整个过程的调控复杂且高效。将国际上最新的相关进展与本实验室工作相结合,详细介绍了假单胞菌属中CbrAB-CrcZ-Crc调控系统的作用机制,有助于提高对微生物碳代谢抑制调控以及环境适应机制的认识。

固氮施氏假单胞菌亚硝酸盐还原酶基因nirS转录特性及功能鉴定

【目的】研究固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501亚硝酸盐还原酶结构基因nir S的转录调控机制及其在反硝化过程中的功能。【方法】构建nir S-lac Z融合载体,利用三亲本结合法将其导入野生型A1501,通过β-半乳糖苷酶活性的测定,分析不同供氧状况、不同浓度的硝酸盐、亚硝酸盐对nir S基因表达的影响;同时将该载体导入rpo N突变株中,研究氮代谢调控因子Rpo N对nir S基因转录影响。通过同源重组方法构建nir S突变株,通过生化表型测定明确nir S在反硝化过程中的功能。【结果】启动子活性测定表明,nir S基因厌氧条件下高水平表达,是好氧条件下表达水平的4倍;nir S的表达受硝酸盐诱导,但不受亚硝酸盐的诱导;Rpo N突变株中,nir S的表达活性为野生型的1/4,nir S启动子未发现Rpo N的保守结合位点,表明nir S的表达受Rpo N间接调控。表型测定显示以硝酸盐为电子受体时Δnir S的反硝化能力降低了约20%;以亚硝酸盐为电子受体时Δnir S仅有微弱的反硝化能力,并且nir S的突变使得菌体在反硝化条件下利用亚硝酸盐的能力显著减弱。nir S突变提高了菌体在亚硝酸为电子受体的反硝化条件下的固氮酶活。【结论】A1501中nir S基因的转录受外界氧及硝酸盐的影响,同时受氮代谢Sigma因子Rpo N的调控。nir S在A1501菌反硝化过程中起关键作用,参与了亚硝酸盐的转化。

固氮施氏假单胞菌bifA基因的功能分析

环二鸟苷酸(c-di-GMP)是细菌中一种重要的第二信使,能够调控多种生理活动。C-di-GMP由两个GTP分子经环化酶(DGCs)合成,而被磷酸二酯酶(PDEs)降解,在铜绿假单胞菌中bifA基因为降解c-di-GMP的基因,参与了胞内c-di-GMP的浓度调节。以固氮施氏假单胞菌A1501中的bifA基因为研究对象,构建了bifA基因突变株;鉴定了bifA基因在c-di-GMP降解及生物膜形成中的功能。结果表明,bifA基因的突变造成了A1501菌中c-di-GMP的积累,同时增强了菌株的生物膜形成能力。此外bifA突变株运动能力大幅下降。由此推测bifA为c-di-GMP降解的关键基因,通过调节胞内c-di-GMP水平间接参与调控了生物膜形成以及菌体运动等生理活动。该结果为解析固氮微生物的信号传递及环境适应机制提供了理论基础。

固氮施氏假单胞菌RpoN蛋白对鞭毛合成的影响

选择性σ因子σ^(54)(又称为RpoN)参与到许多细菌特定基因的转录起始过程,如氮同化基因、四碳二羧酸转运基因以及鞭毛基因。为了研究施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri,A1501)中σ因子RpoN对鞭毛合成的影响,构建了A1501的rpoN缺失突变株与功能回补株,并对野生型、突变株与回补株的鞭毛结构、swimming运动、生物膜形成、根际定殖能力以及鞭毛基因的表达水平进行了比较分析。结果表明:rpo N突变株丧失了鞭毛结构与swimming运动能力,根际定殖与生物膜形成能力相对野生型分别下降了25倍与10倍;此外,rpoN缺失后A1501中大量鞭毛基因发生显著下调;启动子分析发现RpoN除了可能参与调控Ⅱ级、Ⅲ级鞭毛基因外,还可能调控一级基因fli A以及四级基因fliC。以上结果说明RpoN在不同调控等级影响A1501鞭毛的合成,进而影响该菌运动、生物膜形成、根际定殖这些与水稻建立起联合固氮体系息息相关的过程。

固氮施氏假单胞菌电子传递复合体rnf基因簇的功能鉴定

能量供应是限制生物固氮效率的重要因素,电子传递复合体是生物固氮过程中能量产生的重要组成部分。基因组分析表明,在联合固氮菌施氏假单胞菌A1501基因组中存在两套编码电子传递复合体rnf,分别为基因簇rnf1和rnf2,其中rnf1位于固氮基因岛上,rnf2基因簇位于核心基因组上。为了明确两套电子传递体在生物固氮过程中的功能,分别构建了rnf1和rnf2基因簇的突变株并测定了相关表型。结果发现,在基本培养基中两个基因簇的突变都不影响菌体生长,可能相互之间存在着功能互补;固氮酶活性测定结果表明,位于固氮基因岛中的rnf1基因簇缺失造成固氮酶活下降80%以上,而rnf2基因簇的缺失对酶活无显著影响。进一步采用启动子-lac Z融合表达策略探究了基因簇rnf1对固氮酶结构基因nif H转录的影响,发现rnf1极性突变株中nif H的启动子转录活性仅为野生型的17.59%,推测rnf1缺失造成了固氮条件下能量产生匮乏,胞内碳氮比失衡,进而造成固氮系统表达受抑制。

细菌RNA分子伴侣Hfq的研究进展

RNA分子伴侣蛋白Hfq广泛存在于细菌中,最早在大肠杆菌Qβ噬菌体的RNA复制过程中作为必需的宿主因子而被发现。hfq基因的缺失会造成细菌多种表型的变化,对Hfq的全局性调控作用的研究,是当前微生物代谢调控研究中的热点之一。近年来,大量的研究表明Hfq能够通过参与非编码RNA与其靶标mRNAs的互作过程,从而影响mRNAs的稳定性,进而发挥其调控作用。介绍了Hfq蛋白的结构、hfq突变产生的典型表型,并阐述了Hfq参与代谢调控的分子机制以及自身的活性调控,对全面深入了解微生物中Hfq蛋白的功能多样性及调控机制具有指导意义。