我国梅树上病毒及类病毒的检测和鉴定

目前,我国梅树上的病毒种类及发生情况仍不完全清楚。本研究从北京、武汉、南京和无锡的梅园中采集了64份疑似感染病毒的叶片样品,通过RT-PCR和斑点杂交,对7种病毒和2种类病毒进行了检测。共检测到6种病毒和1种类病毒。其中,李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)和桃潜隐花叶类病毒(peach latent mosaic viroid, PLMVd)为我国梅树上的首次检出。PNRSV、亚洲李属病毒2号(Asian prunus virus 2, APV2)、桃叶痘伴随病毒(peach leaf pitting-associated virus, PLPaV)的检出率高于30%。综合考虑病毒的分布及检出率,PLPaV、APV2、PNRSV和李树皮坏死茎痘伴随病毒(plum bark necrosis stem pitting-associated virus, PBNSPaV)是武汉、南京和无锡梅树上的主要病毒。此外,通过克隆和测序,获得了PLMVd和梅树病毒A(mume virus A, MuVA)的基因组,PLPaV的RNA1组分和PNRSV外壳蛋白(CP)基因序列。序列比较分析显示,我国PLMVd梅分离物和PNRSV梅分离物与我国桃分离物亲缘关系最近,表明PLMVd和PNRSV可能在梅和桃树间交互侵染;我国MuVA梅分离物序列与日本梅分离物序列的相似性高达98.56%;PLPaV梅分离物与我国桃分离物之间序列变异较大。上述结果不仅进一步明确了我国梅树上的病毒及类病毒种类和分布情况,而且有助于深入了解它们的流行与传播。

利用高通量测序检测新疆野苹果上的病毒

新疆野苹果Malus sieversii(Ledeb.)Roem.是苹果的祖先,也是重要的育种遗传资源,常用作砧木。近年来,新疆野苹果的分布面积骤减,对其的保护越来越重要。本研究采用高通量测序技术,对采自新疆伊犁天山野果林的26份样本进行病毒检测,检测到苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)。通过RT-PCR检测所有样品(127份),检测到ACLSV、ASPV和苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV),检出率分别为22%、19.7%和11%。结合RACE PCR技术扩增得到ASGV新疆野苹果分离物基因组全长序列,暂时命名为ASGV-XJ。去除3′末端poly(A)后的长度为6506 bp,有两个彼此重叠的开放阅读框(open reading frame,ORF),ORF1(47-6364 nt)编码一个241 kD的多聚蛋白,包含甲基转移酶(methyltransferase)、木瓜蛋白酶(papain-like-protease)、解旋酶(nucleotide triphosphate-binding helicase)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)和C端的外壳蛋白(coat protein,CP)等;ORF2(4798-5760 nt)编码一个36 kD的运动蛋白(movement protein,MP)。系统发育分析表明,分离物间没有表现出寄主专一性和地理分布规律。上述结果对新疆野苹果的保护工作有重要的参考意义。

我国玉米病毒病分布及危害

玉米是我国最重要的粮食作物之一,病毒病害给我国的玉米生产带来了严重损失。本文归纳总结了目前我国玉米上检测到的水稻黑条矮缩病毒、甘蔗花叶病毒、玉米褪绿斑驳病毒等12种病毒的生物学特点和分布情况。同时对玉米粗缩病、玉米矮花叶病、玉米鼠耳病、玉米红叶病和玉米致死性坏死病等主要玉米病毒病害的发生流行、症状危害和防治措施作了介绍。

高通量测序技术在植物及昆虫病毒检测中的应用

在过去的十几年中,测序技术的发展为分子生物学领域带来了革命性的变化。第二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术以快速、高灵敏性、高通量、非序列依赖性等特点极大地促进了病毒诊断学研究领域的发展。NGS技术可以在不了解病毒的生物学特性、血清学特点及基因组信息情况下快速检测未知病毒。通过对总核酸样本进行NGS可以获得某个特定生态环境或种植系统中的所有病毒序列,即病毒组。通过大量的NGS数据可以分析寄主中某一病毒的基因组变化、构建病毒的准种以及研究病毒的进化和起源。本文介绍了高通量测序的方法在植物和昆虫病毒检测中的应用。

黑龙江地区番茄斑萎病毒的鉴定及其部分生物学特征分析

近年来,番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV)在我国多个地区发生严重危害。本研究采用小RNA深度测序和RT-PCR相结合的方法对采自黑龙江的番茄病毒病样品中的病毒进行了鉴定。提取番茄样品的RNA并构建小RNA文库进行测序,数据分析发现比对至TSWV基因组的reads数占比对到病毒核酸总reads数的92.64%,表明侵染此番茄样品的病原物可能是TSWV。利用RT-PCR方法进一步确定侵染此番茄样品的病毒为TSWV,将其命名为TSWV-HLJ1。对TSWV-HLJ1的核苷酸序列进行分析并构建系统进化树,结果表明TSWV-HLJ1与TSWV云南甜椒分离物(TSWV-YNgp)的亲缘关系最近。介体传毒试验表明,西花蓟马可将TSWV-HLJ1传播感染健康寄主植物。摩擦接种试验表明,TSWV黑龙江分离物能够侵染本氏烟、辣椒和番茄。这是我国首次报道在黑龙江地区发现TSWV的危害。

苹果茎痘病毒在山楂中的首次鉴定与序列分析

山楂是我国重要的果树,但山楂病毒的相关研究较少。本研究通过高通量测序及生物信息学分析首次在山楂样品中发现苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)。利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术对ASPV山楂分离物全长序列进行扩增,结果表明,ASPV山楂分离物基因组全长由9290个核苷酸组成,包含5个开放阅读框(open reading frames,ORFs)。ORF1编码与病毒复制相关的蛋白-RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp),其在氨基酸水平上与ASPV苹果和梨分离物的RdRp序列相似性分别为72.8%~80.9%和81.7%~92.8%;ORFs 2~4表达与病毒移动相关的三基因块(triple gene block 1~3,TGB 1~3),其与印度苹果N分离物(LM999967)的氨基酸序列相似性最高,为92.9%~98.2%;ORF5编码外壳蛋白(coat protein,CP),与苹果和梨分离物CP的序列相似性较低,分别为64.8%~88.4%和69.8%~92.2%,高于目前凹陷病毒属病毒新种的划分界限。将ASPV山楂分离物的全长核苷酸序列与其他ASPV分离物的全长序列进行比对,构建系统发育树,结果表明,ASPV山楂分离物与巴西苹果分离物BR-Brae2的亲缘关系最近,但两者核苷酸序列相似性较低(81.5%),说明与其他分离物相比该分离物具有较大的变异性。综上,本研究初步验证了山楂是ASPV的重要自然寄主,并首次获得了ASPV山楂分离物的全长基因组序列,为山楂病毒病诊断和防控策略的制定提供参考。