副猪嗜血杆菌5个重组蛋白的小鼠免疫保护效力比较

为筛选副猪嗜血杆菌(GPS)亚单位疫苗的优势保护性抗原,本研究利用大肠杆菌BL21系统表达了GPS重要抗原r Hps06257、r D15和r Hps0675,及Hps0675 N端和C端的重组蛋白r Hps0675-N和r Hps0675-C,并通过SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达情况。利用His标签蛋白纯化试剂盒纯化5个重组蛋白后,分别与Montanide^(TM)ISA 201 VG佐剂混合制成亚单位疫苗,对小鼠进行2次免疫,并分别在小鼠首免前、一免后21 d和二免后14 d(即首免后35 d)经尾根静脉采血分离血清,利用间接ELISA方法检测各组小鼠的抗体水平。二免后14 d分别利用5倍半数致死剂量(LD_(50))的5型GPS H5L3株和12型GPS H12L3株菌液对小鼠进行腹腔攻毒,攻毒后14 d内观察并记录各组小鼠的临床症状、发病及死亡情况,统计各组小鼠的免疫攻毒保护率。SDS-PAGE检测结果显示,5个重组蛋白均以包涵体形式表达,其表达量占菌体总蛋白的27.46%~42.37%。ELISA检测结果显示,各蛋白疫苗免疫组小鼠的Ig G抗体水平随免疫次数的增加而升高,与PBS对照组相比差异均极显著(P<0.01)。攻毒试验结果显示,分别利用5 LD_(50)GPS 5型H5L3株菌液和12型H12L3株菌液攻毒后,PBS和BL21菌体蛋白对照组小鼠攻毒后24 h内开始发病,3 d内全部死亡;发病小鼠主要症状为精神沉郁,食欲减退或废绝,被毛紊乱,对外界刺激无明显反应等;对死亡小鼠剖检可见其各组织器官的多发性浆膜炎和败血症性病理学变化。各蛋白疫苗免疫组小鼠中也出现了不同程度的发病和死亡情况,其中利用5 LD_(50)H5L3株攻毒后,r Hps06257、r D15、r Hps0675、r Hps0675-N和r Hps0675-C对免疫组小鼠的保护率分别为80%、0、0、40%和80%;利用5 LD_(50)H12L3株攻毒后,上述各组蛋白疫苗对小鼠的保护率分别为80%、20%、20%、10%和60%。本研究首次证实重组蛋白r Hps06257和r Hps0675-C能够诱导小鼠产生较强的免疫保护效力,具有作为亚单位疫苗靶抗原的潜力,为GPS亚单位疫苗候选保护性抗原的筛选奠定基础。

副猪嗜血杆菌主要免疫原性抗原的克隆表达及其反应原性的对比分析

为制备和筛选副猪嗜血杆菌(HPS)具有免疫保护效力的抗原因子重组蛋白,本研究根据GenBank中已登录HPS基因序列,设计引物,分别克隆其OapA、Hps0675(包括全片段和2个子片段)、Hsp60、OmpP2、HbpB、GAPDH、Hps06257和D15抗原因子的10个基因片段,分别将其克隆入pET28a质粒构建重组表达质粒并转化大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,除OapA外,其他9个重组蛋白均正确表达,其表达量占菌体总蛋白的10.20%~31.90%。除rGAPDH以可溶性和包涵体两种形式表达外,其他8个重组蛋白均以包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示,rHbpB、rD15、rHps06257反应原性最强,rGAPDH、rHsp60、rOmpP2反应原性中等,r Hps0675-1、r Hps0675-2、rHps0675反应原性最弱。以His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,9个重组蛋白的纯度在90.72%~98.72%,浓度在1.082 mg/mL~7.936 mg/mL。本研究实现了HPS 9个重要抗原因子的克隆表达和纯化,首次在相同条件下对其反应原性进行了对比分析,为其亚单位疫苗候选保护性抗原蛋白的筛选奠定基础。

红斑丹毒丝菌SpaA的分段克隆及表达

为筛选表达量高且免疫原性强的红斑丹毒丝菌表面保护性抗原A(SpaA)的抗原片段,本研究根据该菌SpaA的结构和功能区将其设计为6个子片段和1个全长片段,采用PCR技术从红斑丹毒丝菌HG-1菌株中扩增出SpaA的7个抗原基因片段,利用原核表达系统克隆并表达后采用SDS-PAGE和western blot检测表达及纯化情况。结果显示,获得7个重组蛋白,分别命名为rSpaA1~rSpaA7,其表达量占菌体总蛋白的17.44%~25.38%,其中rSpaA1、rSpaA2、r SpaA5以包涵体形式表达,r SpaA3以可溶性蛋白形式表达,而rSpaA4、rSpaA6、rSpaA7两种表达形式同时存在。纯化后,rSpaA1~rSpaA7的纯度介于84.22%~93.72%,浓度为0.89 mg/mL~3.25 mg/mL。Western blot结果显示,7个重组蛋白均显示出良好的反应原性,其中rSpaA1、rSpaA3、rSpaA4的反应原性更强。本研究实现了对红斑丹毒丝菌SpaA的分段及其全长的表达和纯化,为SpaA保护性抗原片段的筛选及猪丹毒亚单位疫苗的研发奠定基础。

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