植物蔗糖转运蛋白的基因与功能

蔗糖是植物体内碳水化合物长距离转运的主要(甚至唯一)形式,为植物生长发育提供碳架与能量。蔗糖转运蛋白(sucrose transporter,SUT)负责蔗糖的跨膜运输,在韧皮部介导的源-库蔗糖运输,以及库组织的蔗糖供给中起关键作用。自从菠菜中克隆到第一个SUT基因以来,已先后有多个SUT基因的cDNA得到克隆与功能分析,涉及34种双子叶与单子叶植物。每种植物都有一个中等规模的SUT基因家族,其不同成员之间具有较高的氨基酸序列同源性,但在蔗糖吸收的动力学特性、转运底物的特异性和表达谱等方面存在差异。本文系统介绍国内外(主要是国外)在植物SUT基因的克隆、分类与进化、细胞定位与功能,以及研究方法等方面的研究进展,并简要介绍我们在橡胶树SUT基因研究上的初步结果。

橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因HbLEA1的克隆和表达分析

胚胎晚期丰富蛋白(LEA)是与植物抗逆反应相关的一类重要蛋白。本研究克隆了橡胶树LEA家族一个新基因的全长cDNA序列,命名为HbLEA1。该cDNA全长1 183 bp,其中5'UTR区60 bp,3'UTR区154 bp,CDS区969 bp,共编码322个氨基酸,分子量大小为36 ku,等电点4.84,含有LEA-2和WHy(Water Stress and Hypersensitive response)结构域,属于LEA_2类LEA蛋白。组织表达分析结果表明,HbLEA1在种子中表达量最高,其次是胶乳和稳定叶,在芽中的表达量最低。在未开割树的胶乳中,机械伤害和割胶处理均明显下调HbLEA1表达。在橡胶树幼苗中,低温胁迫处理后该基因在叶片、树皮和根中的表达呈上升趋势,而在高温和干旱胁迫中其表达变化并不明显。结果显示,HbLEA1基因可能参与橡胶树的胁迫应答和胶乳代谢调控。

HbNIN2基因在巴西橡胶树嫩皮和中脉中的RNA原位杂交分析

在橡胶树(Hevea brasiliensis)中,转化酶基因HbNIN2被证明是决定产胶细胞乳管中蔗糖代谢的关键基因,同时在叶片、树皮等多种组织中均有表达。为进一步研究HbNIN2基因的功能,利用原位杂交(in situ hybridization)技术对HbNIN2基因在橡胶树嫩皮和中脉两种组织中的表达区域与表达特点进行研究。结果显示,在橡胶树嫩皮中,HbNIN2基因主要在韧皮部中表达,而在中脉中,HbNIN2基因在除木质部外的其它部位均有表达,同时在两种组织的乳管细胞中HbNIN2基因均有明显的表达信号。比较而言,HbNIN2基因在中脉中的表达量远高于嫩皮。结合其它研究结果,推测HbNIN2基因可能参与橡胶树乳管蔗糖代谢、叶片生长发育调控等。

橡胶树cystatin基因HbCYS1的克隆及割胶应答

在植物中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)广泛参与逆境胁迫应答和发育调控。在已建立的胶乳EST序列数据库中,鉴定了一个注释为cystatin的序列重叠群(Contig)。利用RACE和RT-PCR进一步获得1个长度为947 bp、包含完整读码框(741 bp)的cDNA,命名为HbCYS1;去除N端27个aa的信号肽后,HbCYS1蛋白生成1个包含219个aa的成熟蛋白(24.2 ku),具有cystatin反应位点的保守序列基序GG、QXVXG和A/PW,同时具有植物cystatin所特有的LARFAV基序;推测HbCYS1是一种分泌性蛋白,与同样来自大戟科的1个蓖麻cystatin蛋白(CAA89697)的亲缘关系最近,氨基酸序列的一致性达79%;在胶乳中,割胶明显促进HbCYS1基因的上调表达。割胶是一种典型的非生物胁迫,橡胶树对割胶胁迫的适应能力是决定其持续生产力的一个重要因素,推测HbCYS1基因可能参与橡胶树的胁迫应答与胶乳再生。

橡胶树胶乳C-乳清双向电泳样品制备技术的建立及优化

在TCA/丙酮沉淀法的基础上,用乙醇和乙醚洗涤(称双乙法)沉淀获得橡胶树胶乳C-乳清蛋白样品,并在样品溶解时通过超声助溶进一步提高样品的溶解度。结果显示,利用改良后的样品制备方法(TCA/丙酮+双乙法+超声处理)所获得的C-乳清蛋白样品的溶解性大幅增加,蛋白得率高达8.47 mg/mL C-乳清,为传统TCA/丙酮法的1.6倍;同时降低了盐离子浓度,等电聚焦时升压顺利、聚焦完全,双向电泳的图谱质量明显改善,在银染2D胶上可获得1 206个蛋白点,为传统TCA/丙酮法的2.7倍。本文对胶乳C-乳清蛋白样品制备方法进行深入优化,获得了重现性较好的高质量双向电泳蛋白图谱,促进了橡胶树蛋白质组学研究。

橡胶树3个品系产排胶特性季节变化的比较

以S/2 d3割制,对3个品系(热研8-79、热研7-33-97、PR107)的幼龄开割树割胶,分析和比较株次产量、胶乳转化酶活性、pH值、蔗糖和总固形物含量的季节变化。结果表明:几乎所有割胶季节,热研8-79的株次产量、胶乳转化酶活性、pH值都明显高于热研7-33-97和PR107,蔗糖含量依次为热研8-79<热研7-33-97<PR107,总固形物含量3个品系差异很小,显示热研8-79乳管蔗糖利用率较高,胶乳再生能力较强的品系特性,而PR107则相反。3个品系均分别在5月、7-8月、10-11月形成产量高峰,但不同品系同次产量高峰的时间跨度有很大差异。3个品系在4月中旬至5月上旬株次产量、转化酶活性、pH值、蔗糖含量均呈递增趋势变化,总固形物含量呈递减趋势变化,显示胶树胶乳再生作用逐渐增强,排胶越来越顺畅的变化过程。在其它季节,株次产量、胶乳转化酶活性和生理参数的变化比较复杂,并且经常不同步,显示株次产量受多种因素的综合影响,该结果可为适宜割胶制度的制定提供参考。

橡胶树3种割胶制度的产排胶特性变化比较

30株成龄未割胶树(热研7-33-97)被分成3组,分别用S/2 d1、S/2 d3、S/2 d5割制割胶,分析第1至第10割次干胶产量、胶乳生理特性的变化。结果表明,第1至第6割次,3种割制的干胶产量递增,相同割次干胶产量差异不显著。第7至第10割次,S/2 d1和S/2 d3割制干胶产量小幅波动并趋于稳定,S/2 d5割制干胶产量递增。第1至第7割次,C-乳清转化酶活性递增,然后趋于稳定。第1至第10割次,胶乳总固形物含量递减,无机磷含量和硫醇含量递增。蔗糖含量在第1至第6割次递减,然后递增。当总固形物含量>40%时,总固形物含量与干胶产量极显著负相关;当总固形物含量<40%时,两者不相关。第1至第10割次总固形含量、无机磷含量、硫醇含量的变化均有利于C-乳清转化酶提高活性。

木霉菌对橡胶树褐根病菌的拮抗作用

探讨9个木霉菌株的生长与产孢特性,并通过对峙培养法,测定了9个木霉菌菌株对橡胶树褐根病菌的拮抗作用。结果表明,HCS、DJ1和ACCC31757生长速度最快,平均生长速度在4.5cm·d-1以上,ACCC30536平均生长速度最慢,只有1.5cm·d-1;9株木霉菌对橡胶树褐根病菌的拮抗作用差异较大,其中有3株木霉菌对橡胶树褐根病病原菌具有显著的拮抗作用,在第8d,ACCC31642和HCS对褐根病病原菌的抑制率达到100%,ACCC31639对褐根病病原菌的抑制率达到93.33%。

巴西橡胶树中碱性转化酶HbNINa基因的克隆和表达模式分析

检索橡胶树EST和基因组数据库,发现了1个在叶片中高丰度表达的中碱性转化酶基因。采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因的cDNA和基因组序列,命名为HbNINa。序列分析结果显示,HbNINa基因cDNA序列的编码区(CDS)序列长度为1 719 bp,对应的基因组序列为3 696 bp。序列分析表明,该基因编码571个氨基酸多肽,推测其分子量大小为65.7 ku,等电点为6.36。HbNINa蛋白包含植物中碱性转化酶的全部保守结构域。基因组结构分析显示HbNINa基因包含4个外显子和3个内含子。QPCR分析结果表明,HbNINa基因在在胶乳中表达水平极低,而在其他组织如树皮、树叶和雌花中的表达丰度相对较高。在叶片发育过程中,HbNINa在叶片发育的初期高丰度表达,推测HbNINa可能参与叶片蔗糖利用,进而在橡胶树叶片发育过程中起重要作用。

橡胶树PGAM基因的克隆及表达特性分析

从橡胶树中克隆并获得磷酸甘油酸变位酶基因(HbPGAM),该基因的cDNA序列全长1 559 bp,包含长度为1 260 bp的完整开放阅读框,编码一个由419个氨基酸残基组成的蛋白,氨基酸同源性分析发现,该蛋白含有保守的磷酸变构酶组氨酸磷酸酶结构域,属于磷酸甘油酸变位酶。生物信息学分析显示,HbPGAM蛋白无导肽酶切位点,不具有跨膜结构域且为亲水蛋白,该蛋白可能在细胞质中发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,HbPGAM基因在分析的7种组织中均表达,但在胶乳(产胶细胞乳管的细胞质)中的表达水平最高,且该基因在胶乳中的表达受割胶影响,推测其参与橡胶树胶乳再生过程。此外,HbPGAM基因表达受部分植物激素如乙烯利ET、植物生长素2,4-D及水杨酸SA调控,但调控不明显。结果说明,胶乳再生过程中HbPGAM对胶乳糖酵解起到一定的调控作用,为全面了解橡胶树PGAM家族奠定理论基础。

橡胶树α-维管蛋白基因HbTUA1的克隆及表达分析

利用橡胶树胶乳EST文库克隆到一个TUA基因,命名为HbTUA1(GenBank登录号:KC333454)。该基因cDNA全长1 580 bp,其中5′UTR长45 bp,3′UTR长167 bp,编码区长1 368 bp,编码449个氨基酸。HbTUA1蛋白具有TUA类蛋白保守的GTP结合域。荧光定量PCR分析显示,HbTUA1基因在橡胶树胶乳中的表达量最高,其次是树皮和芽,而在种子和叶片中的表达量最低;在胶乳中,HbTUA1基因的表达显著受割胶和伤害诱导,在不同死皮程度的橡胶树中也存在明显差异。初步表明HbTUA1基因可能参与橡胶树胶乳再生与胁迫应答调控。

8株木霉菌对橡胶树红根病的拮抗作用

木霉菌具有抑制植物病原真菌生长的能力,因而成为开发土传根部病害生防菌的首选之一。利用对峙培养法,测定8个木霉菌菌株对3个橡胶树红根病病原真菌的体外拮抗作用,并对筛选出来的木霉菌进行相互间的对峙培养分析。结果表明:有6个木霉菌对3个红根病病原菌具有显著拮抗效果;所选出的6个木霉菌之间尽管多数可以共存,但存在空间和营养竞争,尤其是棘孢木霉,很容易被其它木霉菌抑制和侵占,因此,在今后使用时不适宜混配。该实验结果可为进一步筛选和利用生防菌防治橡胶树根部病害提供理论依据。

巴西橡胶树PEPRK基因家族成员的鉴定和表达分析

PEP羧化酶激酶相关激酶(PEP carboxylase kinase-related kinases,PEPRKs)是CDPK-Sn RK超家族的一员,目前对其生理功能尚不清楚。本研究以拟南芥和杨树的PEPRK序列作为探针,对橡胶树和其他5种植物(木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥)的基因组和转录组数据进行全面搜索,共鉴定得到25个PEPRK基因家族成员,其中包括5个橡胶树PEPRK基因,命名为Hb PEPRK1-5。序列分析发现橡胶树PEPRK和其他植物类似,在序列中部含有一个相对比较保守的激酶结构域,而两端的同源性相对较低。在基因结构和进化方面,PEPRK主要分为2个大的分支,相同分支的成员在结构域和内含子分布上更为相似,其中橡胶树和木薯PEPRK在进化上具有较近的亲缘关系。在基因的表达方面,Hb PEPRK1主要在稳定期的叶片中表达,Hb PEPRK2和Hb PEPRK5在树叶、树皮和胶乳中均有表达,Hb PEPRK4主要在种子中表达;另外,研究发现橡胶树PEPRK家族成员的表达还与叶片发育、乙烯利刺激、真菌侵染和低温胁迫具有一定的相关性。

巴西橡胶树PPCK基因家族成员的鉴定和表达分析

以已发表的PPCK序列为探针,对橡胶树和其他5种植物(木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥)的转录组和基因组进行全面搜索,鉴定得到17个PPCK基因,其中包括3个橡胶树PPCK基因,命名为Hb PPCK1-3。序列分析发现,Hb PPCK1-3和其他植物一样在结构上非常保守,只有一个内含子和一个蛋白激酶结构域,并且相对位置也比较一致。在进化上,橡胶树、木薯和蓖麻3种大戟科植物的PPCK蛋白具有较近的亲缘关系。Hb PPCK3在树皮中表达丰度最高,其次是种子和雄花;Hb PPCK2在胶乳和根中表达丰度相对较高,而Hb PPCK1在各组织中的表达都比较低。另外,大部分家族成员的表达都受到真菌侵染、低温和干旱胁迫处理的诱导,而乙烯利处理却能抑制Hb PPCK2的表达。

橡胶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂HbCYS2的克隆与表达分析

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin,CYS)广泛参与植物的生长发育调控、生物与非生物胁迫应答过程。从橡胶树中获得1个CYS基因,ORF长度为687 bp,编码1个由228个氨基酸残基组成的蛋白,生物信息学分析发现该蛋白含有2个CYS结构域,以及1个含有30个氨基酸残基的信号肽,为分泌蛋白,推测属于植物CYS II型,命名为Hb CYS2(Gen Bank:KX161925)。表达分析发现Hb CYS2在胶乳中高表达,并且受割胶和产量调节剂ET调控;在叶片组织中,Hb CYS2对多主棒孢侵染表现出明显应答。由此推测,胶乳中Hb CYS2在橡胶树胶乳再生、以及割胶伤害应答中发挥一定的调控作用,叶片中Hb CYS2参与橡胶树棒孢落叶病的防御或抵抗。

橡胶树叶片转化酶提取方法的比较

比较液氮研磨样品与蛋白抽提液研磨样品对6种提取橡胶树叶片转化酶方法的效果。结果表明:液氮研磨法对转化酶活性影响很大,特别是中性/碱性转化酶和细胞壁结合的酸性转化酶已基本失活,而可溶性酸性转化酶活性丧失也比较严重。利用蛋白抽提液研磨样品,用Hepes-NaOH法提取的可溶性转化酶的酶活性最高,达472.44μmol(glucose)/[g(FW).h];虽然磷酸-柠檬酸法获得的粗酶液的蛋白含量较低,但其酶活性高达441.61μmol(glucose)/[g(FW).h];Tris-HCl法提取的细胞壁结合酸性转化酶的酶活性最高,达35.83μmol(glucose)/[g(FW).h]。从转化酶的比活力看,磷酸-柠檬酸法最佳,所提取的可溶性转化酶比活力约为Hepes-NaOH法的4倍。本研究结果为进一步完善橡胶树叶片转化酶的提取方法提供重要的指导意义。

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树转录组数据库进行搜索,并设计引物进行PCR扩增,得到7个橡胶树钙调蛋白基因的c DNA序列,命名为Hb Ca M1-7。序列分析结果发现,Hb Ca M1-7的CDS序列均为450 bp,编码149个氨基酸,分子量为16.8 ku,等电点为3.95。其中,Hb Ca M1-6间氨基酸同源性为100%,Hb Ca M7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面,Hb Ca M1-7均为一个内含子,且内含子的插入位置相同,但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出,钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面,Hb Ca M1-6在各组织中均有表达,除了Hb Ca M3在根中表达丰度相对较高,其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高,而Hb Ca M7在各组织中的表达均比较低;乙烯利处理后,Hb Ca M2-7的表达均有一定的上升趋势,而在叶片发育过程中Hb Ca M1-5碷呈明显下调表达。由此可见,橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。

巴西橡胶树CCaMK基因家族成员的鉴定和表达分析

钙/钙调素依赖型蛋白激酶（CCa MK,calcium-and calmodulin-dependent protein kinase）是一种钙离子结合蛋白,在钙信号传导过程中起重要作用。本研究以已发表的CCa MK序列作为检索序列,对橡胶树和其他5种植物（木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥）的基因组和转录组数据进行全面搜索,鉴定得到6个CCa MK基因,其中包括一个橡胶树CCa MK基因,命名为Hb CCa MK1。序列分析发现：5种植物的CCa MK氨基酸序列同源性较高,为73%~94%。基因结构分析发现,Hb CCa MK1和所分析的其他植物CCa MK一样均,含有6个内含子、1个蛋白激酶结构域和3个EF-hand结构域;从结构和进化上看,Hb CCa MK1和蓖麻、木薯2种植物的CCa MK具有较近的亲缘关系;在表达方面,Hb CCa MK1在橡胶树根中表达丰度最高,其次为树叶和花;另外,Hb CCa MK1的表达还与叶片发育、真菌侵染和低温胁迫有关。

橡胶树基腐病致病菌——木贼镰刀菌的分离及鉴定

镰刀菌种类繁多,地理分布复杂,寄主范围广,寄生繁殖能力强,大部分对植物具有致病性和毁灭性。近来,由镰刀菌引起的橡胶树病害在中国植胶区内发生并呈现逐渐增加趋势。为了查明海南广坝植胶区的一株橡胶幼树枯死的原因,本文通过病原菌分离、形态学、分子生物学和致病性鉴定等方法,最终确定该致病菌是一种木贼镰刀菌(Fusarium equiseti),这里命名为Fusarium-Hb。由于该镰刀菌在条件合适的情况下致病性强,又因为其对温度(16℃~35℃)和pH适应范围广(pH 4~11),光照比黑暗条件下更易形成孢子,能产生大量大、小分生孢子及厚垣孢子,因而该病原菌是需要引起重视的病原菌。另外,本研究通过5种单剂药效筛选试验表明,40%福星乳油是防治该镰刀菌的首选药剂;其次为70%甲基托布津可湿性粉剂。本文是木贼镰刀菌引起橡胶树枯死的致病菌的首次报道,并为大田防治提供了有效的防治药剂。

巴西橡胶树膜联蛋白基因家族成员的鉴定和表达分析

膜联蛋白是一个多基因家族,在植物逆境胁迫应答和生长发育等方面起重要作用。本研究以已发表的膜联蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树和其他5种植物的转录组和基因组进行搜索,鉴定得到14个橡胶树膜联蛋白基因家族成员,命名为AnnHb1-AnnHb14。基因结构分析发现,14个家族成员的内含子数目为3-6个,结构域的数目为2-4个。在进化上,橡胶树、木薯和蓖麻共3种大戟科植物的膜联蛋白具有较近的亲缘关系。表达方面,AnnHb1在各组织中普遍表达,而AnnHb6和AnnHb7主要在胶乳中表达,AnnHb10、AnnHb8和AnnHb13分别在树叶、树皮和雄花中特异表达,其他成员在各组织中低丰度表达或不表达;部分家族成员的表达还与叶片发育、乙烯利刺激、真菌侵染和低温胁迫等具有一定相关性。