RNA结合基序蛋白家族在肿瘤发生发展中的作用及机制研究进展

恶性肿瘤是世界上各个国家居民死亡的主要原因之一,也是延长人类预期寿命的重要障碍。RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)作为一种重要的细胞内蛋白,在RNA转录、剪接、翻译、修饰、运输和稳定性等方面发挥着至关重要的作用。RNA结合基序蛋白(RNA binding motif proteins,RBMs)是一个重要的RBPs家族亚群,具有与RBPs相同的结构域特征。已有的研究显示,RBMs蛋白家族成员与多种肿瘤的发生发展密切相关。该文就RBMs家族成员在肿瘤发生发展中的作用及机制进行综述。

黄鳝单条染色体的显微分离及特异性检测

建立了显微分离黄鳝单条染色体及检测其特异性的方法。在Olympus倒置显微镜下用毛细玻璃微针手工分离黄鳝减数分裂Ⅰ终变期 3号染色体 ,将其DNA作模板进行DOP PCR扩增后 ,分别以α-3 2 P dCTP和Biotin 11 dUTP标记的单条染色体DNAPCR扩增产物及Biotin 11 dUTP标记的大豆 18SrRNA基因作探针进行Southern杂交、FISH和Dot杂交来检测其特异性。结果表明 :(1)减数分裂Ⅰ终变期染色体标本是进行染色体显微操作的理想材料 ;(2 )DOP PCR扩增产物片段在 2 0 0～ 10 0 0bp之间 ,平均 6 0 0bp左右 ;(3)杂交结果显示 ,本研究所获得的单条染色体是黄鳝 3号染色体 ;(4 )与显微操作仪和微激光分离相比较 ,该方法不需要昂贵仪器 ,在常规实验室即可操作 。

应用PRINS技术定位黄鳝Hox基因的研究

Hox基因是近年来发现的支持基因组复制进化理论的最有力的证据。该研究应用引物原位延伸 (PRINS)技术 ,在黄鳝有丝分裂染色体标本上开展Hox基因的定位研究。研究结果表明 ,在黄鳝染色体组中可能存在有 6个Hox基因簇 ,这些基因簇分别位于黄鳝第 1、2、3、6、8和 10号染色体 ,相对着丝粒距离分别为 2 8 2 4± 2 88、4 5 5±1 39、13 89± 2 0 3、74 32± 1.86、38 0 3± 2 .4 1和 5 8 18± 2 0 5。该研究定位黄鳝Hox基因将有助于挖掘黄鳝染色体的来源和进化特征 ,并为基因组复制进化理论提供黄鳝这一特化物种的细胞遗传学证据。

顺铂诱导人小细胞肺癌细胞系NCI-H446细胞的凋亡

背景与目的：近年的研究表明,诱导细胞凋亡是多种作用于核酸代谢不同环节的化疗药物抗肿瘤的重要机制.但顺铂杀灭人小细胞肺癌（SCLC）细胞的药物效应除了损伤其DNA外,诱导该类恶性肿瘤细胞凋亡是否是其杀灭细胞的重要机制尚无相应研究.基于此,本研究旨在探讨顺铂诱导人SCLC细胞系H446细胞凋亡的机制及其在SCLC化疗中的作用.方法：分别采用形态学观察、流式细胞仪分析技术和原位DNA断裂点的末端标记法,检测顺铂诱导H446细胞的凋亡作用.结果：终浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/ml的顺铂均可诱导H446细胞凋亡,且呈浓度依赖性（处理48 h时,其凋亡指数分别为1.47±0.03、8.28±0.54、11.02±1.05、12.74±1.08、27.16±1.15）;终浓度为2 μg/ml的顺铂在24～72 h持续诱导细胞凋亡且诱导凋亡作用逐渐增强,呈时间依赖性;终浓度为5 μg/ml的顺铂可阻滞H446细胞于细胞周期的S期,终浓度＜5 μg/ml顺铂可阻滞H446细胞于细胞周期的G2期和S期.结论：诱导细胞凋亡可能是顺铂抗肿瘤作用的重要机制.

ZFX基因同源序列在黄鳝基因组中的检出及其染色体定位(英文)

以大熊猫锌指蛋白基因Zfx为探针 ,在黄鳝基因组DNA中检测到一条长约 9 5kb的杂交带。依据哺乳类和爬行类动物锌指蛋白基因 (ZFX/Zfc)编码第 7～ 13个锌指结构的DNA序列保守性设计引物 ,在黄鳝基因组DNA中仅扩增到一条 5 12bp的DNA片段。将此片段克隆至载体 pBS中 ,从雌性、雄性个体中分别挑选 4个含有插入片段的白色克隆进行测序。测序结果表明 ,这些克隆中插入片段的核苷酸序列一致。该DNA片段在核苷酸水平上与人类ZFX和ZFY分别具有 88%和 87%同源性 ,但其与美洲鳄鱼Zfc的同源性可达 90 % ,而在氨基酸水平上则分别存在 95 9%、95 9%和 93 5 %的同源性 (170个氨基酸 )。该基因命名为黄鳝锌指蛋白基因Zfa ,并运用FISH将其定位于黄鳝 1号染色体 ,距离着丝粒的相对位置为 6 0 1± 0 38。通过进一步研究证明 ,黄鳝 1号染色体上存在有真兽类哺乳动物X染色质同源的保守片段 ,该保守片段有可能就是哺乳动物X染色体起源和进化的原始物质基础之一。应用哺乳动物X染色体连锁的其他基因在鱼类开展染色体比较定位研究 。

黄鳝激素敏感性脂肪酶基因Hsl染色体原位杂交定位

动物脂肪组织中的甘油三酯在数量上是最重要的储存能源。Hsl基因所编码的激素敏感性脂肪酶是一种多功能酶。它通过催化水解储存在脂肪组织中的甘油三酯,以及卵巢、肾上腺、睾丸和胎盘中的胆固醇酯,在机体能量供应和类固醇生成作用中发挥重要作用。本研究以放射性同位素和地高辛标记重组质粒pBS中所含猪Hsl基因作为探针,分别与PstⅠ酶切的黄鳝基因组总DNA和有丝分裂染色体标本进行Southern杂交和荧光原位杂交(FISH)。结果显示,Southern杂交呈现一条带,片段长度约为11.5kb。同时,应用FISH定位Hsl基因于黄鳝5号染色体,相对着丝粒距离为78.35±1.26。该定位结果与应用"特定染色体DNA池"定位黄鳝Hsl基因结果相符,且定位结果更为精细。表明在淡水鱼类黄鳝基因组中存在Hsl基因,另一方面也首次提供黄鳝5号染色体上FISH杂交信息,从而为增加黄鳝染色体组中已知的遗传标记和建立高精度遗传图谱奠定基础。

小细胞肺癌分子细胞生物学的研究进展

在癌变的过程中,发生了多种遗传变异和生物学改变。遗传变异和生物学改变的结合,则促进肿瘤的恶性发展。小细胞肺癌是一种多基因参与和协同作用的恶性肿瘤,临床表现为早期广泛转移,以及对化疗药物初次敏感但易产生耐药性和复发等。目前,对小细胞肺癌而言,在了解其恶性转化的分子细胞生物学机制基础上,制定新的治疗方案迫在眉睫。小细胞肺癌的分子细胞生物学特征常表现为多种染色体异常,最为常见的是3p缺失,以及癌基因和抑癌基因的变异。伴随着遗传变异,小细胞肺癌还表现出细胞表面受体的过度表达,包括受体酪氨酸激酶、G蛋白耦合受体、整合蛋白及其它受体等。一些被激活的下游分子,例如磷脂酰肌醇激酶,有可能成为新的治疗方案的靶位点。

染色体微切割、微分离、微克隆技术及其研究进展

自1981年染色体微切割及微克隆技术创建以来 ,该技术已广泛应用于人类及动植物遗传学、医学、进化学等研究领域 ,主要包括构建特定染色体或染色体区域的DNA文库、制备染色体描绘探针池以研究染色体重排和染色体进化等。本文对该技术的产生、发展及某些研究进展作一综述。

染色体不稳定性与肺癌及其研究策略

肺癌的常规化疗效果差 ,特别是复发性肿瘤 ,常产生对原化疗药物和其他药物的多药耐药性。已有的研究表明 ,恶性肿瘤及其耐药细胞存在遗传不稳定性。这些遗传不稳定性导致了肿瘤及其耐药性的产生。遗传不稳定性以微卫星不稳定性和染色体不稳定性两种形式存在。其中 ,染色体不稳定性具体表现为染色体数目的改变和染色体结构的改变。

APACHEⅡ评分和降钙素原对肺部感染预后的预测作用

目的探讨APACHEⅡ评分和降钙素原对重症监护室肺部感染患者预后的预测价值。方法收集2012年3月到2013年5月本院重症监护室肺部感染患者的临床资料，包括年龄、性别、APACHEⅡ评分、动脉血气、血沉、C-反应蛋白、乳酸、降钙素原、28d结局、ARDS发生情况等，绘制受试者工作特征曲线，比较APACHEⅡ评分和降钙素原对肺部感染患者28d结局及并发ARDS的预测价值。结果纳入患者78例，其中28d内死亡19例，1周内发展为ARDS33例。死亡组APACHEⅡ评分和降钙素原显著高于存活组，分别为[（23．3±7．5）椰（15．5±6．2），P〈0．001]和[18．6（1．5—25．0）ng/mLvs1．0（0．3—25．0）ng/mL，P=0．044]，氧合指数低于存活组，为[（189．7±89．4）YS（238．0±91．7），P=0．048]。ARDS组APACHEⅡ评分和降钙素原显著高于非ARDS组，分别为[（19．9±8．3）VS（15．6±6．0），P=0．013]和[8．3（1．2—25．0）ng／mLvs0．7（0．2—21．8）ng／mL，P=0．016]，氧合指数低于非ARDS组，为[（190．9±82．6）vs（252．1±92．4），P=0．003]。APACHEⅡ评分和降钙素原对28d结局有一定预测作用，APACHEⅡ评分的预测作用大于降钙素原（AUROC：0．797vs0．652，P=0．057）。APACHEⅡ评分和降钙素原对并发ARDS也有一定预测作用，两者预测作用相当（AUROC：O．651vs0．657，P=0．929）。APACHEⅡ评分和降钙素原联合后对28d结局及并发ARDS的预测作用较两者单独的预测作用无显著提高。结论APACHEⅡ评分和降钙素原可以作为肺部感染预后的预测指标，有助于临床早期甄别预后差及具有ARDS高危倾向的患者。

Canstatin基因表达载体的构建及其生物学效应研究

目的 构建可表达人血管生成抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,探索canstatin对人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)和人肺腺癌A5 49细胞株的生物学效应。方法 RT PCR法从胎儿肝组织中获取canstatincDNA全长 ,并将其克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上。阳离子脂质体介导该重组载体转染HUVE细胞系、A5 49细胞株。RT PCR法检测其对canstatinmRNA的表达。台盼蓝拒染法活细胞记数 ,3 H TdR掺入法检测细胞增殖 ,TUNEL法检测细胞凋亡 ,流式细胞术检测细胞周期。结果 成功构建pCMV Script Cans真核表达重组载体 ,并在转染该表达载体的A5 49及HUV EC C细胞株中均检测到canstatinmRNA的表达。HUV EC C细胞株pCMV Script Cans载体转染组比空载体组 3 H TdR掺入量明显减低(P <0 0 1) ,细胞凋亡率明显增加 (P <0 0 1) ,A5 49细胞株转染组与空载体组 3 H TdR掺入量无显著差异 (P >0 0 5 ) ,细胞凋亡率无显著差别 (P >0 0 5 )。结论 pCMV Script Cans重组载体能在转染的哺乳动物细胞中表达canstatin ,并抑制内皮细胞增殖 ,诱导内皮细胞凋亡 ,但对肿瘤细胞没有直接抑制作用。

顺铂诱导人小细胞肺癌多药耐药细胞系NCI-H446/CDDP的建立及其生物学特征分析

目的 建立人小细胞肺癌多药耐药细胞系 ,鉴定其细胞生物学特性。方法 以顺铂为诱导药物 ,人小细胞肺癌细胞系NCI H4 4 6为诱导对象 ,采用首次大剂量冲击和逐步增加剂量结合的方式 ,建立人小细胞肺癌多药耐药细胞系NCI H4 4 6 /CDDP。细胞计数法绘制生长曲线 ,计算其倍增时间 ;MTT法测定细胞IC50 ,计算其耐药指数 ;光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察其形态。结果 经过 8个月的诱导 ,成功建立了人小细胞肺癌多药耐药细胞系NCI H4 4 6 /CDDP ;生长曲线测定结果表明 ,亲代和耐药细胞增殖速度接近 ,其倍增时间分别为 4 0 72h和 4 1 80h;流式细胞仪检测细胞周期发现 ,耐药细胞系中S期细胞所占比例为 2 0 2 4 % ,亲代细胞系中S期细胞所占比例为18 4 2 % ,二者比较差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ,而G0 /G1和G2 /M期细胞无显著性变化 ;MTT结果表明 ,耐药细胞系对顺铂、羟基喜树碱、长春新碱、5 氟尿嘧啶和拓扑替康等 5种化疗药物有不同程度的耐受性 ,其耐药指数分别为 85 0 0、4 2 75、6 0 2 8、2 4 31、12 4 7;细胞超微结构显示 ,耐药细胞较其亲代体积增大 ,核浆比例降低 ,线粒体、高尔基体、粗面内质网和游离核糖体增多 ,细胞表面指状突起增多。结论 NCI H4 4 6 /CDDP细胞生物学性状稳定 ,是一?

多西紫杉醇对肺腺癌多药耐药细胞A549/CDDP及其亲代细胞作用机制的初步研究

目的 探讨多西紫杉醇对肺腺癌多药耐药细胞A5 49/CDDP及其亲代细胞的生长抑制作用及其抗肿瘤作用机制。方法 应用MTT比色法和透射电镜等方法,观察A5 49/CDDP及其亲代细胞在多西紫杉醇作用后,细胞生长曲线、生长抑制率及形态学等方面的变化。结果 MTT比色结果表明,多西紫杉醇对A5 49/CDDP细胞及其亲代细胞具有明显的生长抑制作用,并且在0 1～2 μg/ml剂量范围内存在剂量及时间依赖关系。A5 49/CDDP细胞在多西紫杉醇作用12～2 4h较亲代细胞敏感(P <0 0 1) ,在48h开始表现出其药物耐受性(P <0 0 1) ,在72h则与亲代细胞间无显著性差异(P >0 0 5 ) ;透射电镜观察结果发现,A5 49/CDDP细胞及其亲代细胞的胞质内空泡均明显增多,微绒毛减少甚至消失,线粒体出现肿胀甚至空泡化,同时,还存在少数凋亡小体和脱落的不含细胞器成分的细胞质。结论 多西紫杉醇对肺腺癌多药耐药细胞及其亲代细胞均具有明显的生长抑制作用,并可能通过诱导肿瘤细胞坏死、凋亡和胞质自切,从而发挥其细胞毒作用。

受体相互作用蛋白140在脓毒症急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞中的表达及其作用

目的探讨受体相互作用蛋白140（receptor interacting protein140,RIP140）在脓毒症急性肺损伤（acute lung injury,ALI）大鼠肺泡巨噬细胞中的表达及其在炎症反应过程中的作用。方法 36只雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、假手术组和盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症肺损伤3、6、12、24 h组。HE染色观察肺组织病理变化;免疫组化检测RIP140在肺组织的表达分布;Western blot及免疫荧光观察肺泡巨噬细胞RIP140的表达变化及定位;RT-q PCR测定肺泡巨噬细胞IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA水平变化。结果 CLP组可见明显肺损伤病理改变且随时间进展逐渐加重。RIP140在脓毒症肺损伤大鼠肺组织中主要表达于炎性渗出细胞,且随时间进展,表达RIP140的细胞数量逐渐增多。CLP术后6 h大鼠肺巨噬细胞RIP140蛋白表达水平较正常对照组开始升高（P〈0.05）,至12~24 h维持一较高水平,且主要表达于细胞核。CLP术后3 h大鼠肺巨噬细胞IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA水平较正常对照组开始升高（P〈0.05）,至12~24 h维持一较高水平,下调肺泡巨噬细胞RIP140的表达可明显抑制IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA的表达。结论脓毒症肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞可通过上调RIP140表达增强肺组织炎症反应,从而参与早期急性肺损伤的炎症应答。

多重逆转录聚合酶链反应检测常见呼吸道病毒

目的建立一种可同时快速检测引起人呼吸道感染的重要病毒病原的检测方法。方法通过对PCR反应条件的优化,建立同时检测季节性甲型流感病毒(INFA)、乙型流感病毒(INFB)、人鼻病毒(HRV)和甲型H1N1流感病毒(H1N1)的多重RT-PCR方法。结果该法可同时或分别扩增INFA 212 bpI、NFB 489 bp、HRV 380 bp和H1N1 153 bp的基因片段。检测的敏感性分别为104、104、103、104copies/mL。采用相同的反应体系和条件,分别对其他6种常见病原体(包括肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌核酸)进行扩增,均未检测出扩增产物。结论此种多重RT-PCR法适用于4种重要呼吸道病毒的快速甄别。

DNA错配修复基因甲基化在H446细胞获得性耐药中的作用

目的探讨DNA错配修复基因MLH1(human MutL homolog1)、MSH2(human MutS homolog2)甲基化在人小细胞肺癌H446细胞获得性耐药中的作用。方法RT-PCR及Western blot法检测H446细胞及其多药耐药细胞H446/DDP中MLH1、MSH2基因的mRNA表达和蛋白表达,甲基化特异性PCR(MSP)法检测MLH1、MSH2基因启动子CpG岛甲基化状态。结果H446/DDP细胞中MLH1、MSH2基因的mRNA及蛋白水平均较H446细胞显著降低(P<0.01),且其启动子甲基化程度明显增强。结论DNA错配修复基因MLH1、MSH2启动子甲基化诱导其表达下调可能是人小细胞肺癌获得性耐药的重要机制之一。

人小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP基因组DNA甲基化状态的变化

目的探讨基因组DNA甲基化状态与人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)H446/CDDP细胞获得性多药耐药的关系。方法分别提取人SCLC多药耐药细胞H446/CDDP及其亲代细胞H446的基因组DNA,应用甲基化敏感性随机引物PCR(MS-AP-PCR)方法检测其甲基化状态。结果 H446/CDDP细胞经酶解后的扩增谱带较H446细胞明显增多,且荧光强度较强,表明其基因组DNA甲基化水平较亲代细胞明显增高。结论 H446/CDDP细胞多药耐药性的获得可能与其基因组DNA甲基化水平增高有关。

人小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达基因的克隆研究

目的构建小细胞肺癌多药耐药细胞(H446/CDDP)差异表达消减cDNA文库。方法①以H446/CDDPcDNA为实验方(Tester),小细胞肺癌细胞H446cDNA为对照方(Driver),应用抑制消减杂交(SSH)技术结合T/A克隆技术构建小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达消减cDNA文库。②通过斑点杂交筛选、测序及同源性分析获取H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段。结果成功构建了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP差异表达消减cDNA文库,获得21个H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段,经测序及同源性分析表明它们分别代表6个已知基因(同源性为96%～100%)。结论SSH技术是筛选新的功能基因的有效方法;获取的6个差异表达基因可能参与了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP的耐药形成,进一步的功能研究有利于了解它们在小细胞肺癌多药耐药机制中所发挥的作用。

急性高山病发病机制的研究进展

急性高山病（acute mountain sickness,AMS）是指机体由平原进入海拔2400m以上的高原地区或久居高原者进入更高海拔地区所发生的一种以头痛为核心症状的疾病。AMS缺乏特异性的临床症状和体征,典型的临床症状包括头痛、头晕、心悸、胸闷、气短、乏力、食欲缺乏、恶心、呕吐、睡眠障碍等。

多重PCR检测DMD/BMD患者DMD基因外显子缺失的实验研究

目的探索建立Duchenne/Becker肌营养不良(DMD/BMD)的稳定高效的基因诊断方法,为该疾病的临床鉴别诊断提供参考。方法收集2008年5月-2010年5月在第三军医大学新桥医院就诊的汉族男性DMD/BMD患者64例,年龄0.7～45(9.3±1.1)岁。抽取患者外周静脉血5ml,提取基因组DNA后,采用多重PCR(mPCR)扩增DMD/BMD患者DMD基因缺失热区内的18个外显子,确定DMD/BMD患者DMD基因外显子缺失类型。结果 64例DMD/BMD患者中,31例(48.44%)存在DMD基因缺失热区内的不同外显子缺失。其中,外显子50缺失频率最高,为35.48%(11/31);外显子47和43次之,分别为32.26%和25.81%(10/31和8/31),外显子45和49缺失率均为19.35%(6/31),外显子19和48缺失率均为16.13%(5/31)。缺失的外显子主要集中在DMD基因的中央缺失热区和5′端缺失热区。结论目前国内外采用的mPCR方法在DMD/BMD患者的临床诊断中发挥了重要作用。探索DMD基因其他缺失热点、重复突变热点或点突变热点,并以此为依据建立新的DMD/BMD基因诊断方法仍然是提高DMD/BMD基因诊断率的发展方向。