小檗碱/IGF-I对猪体外受精胚胎发育作用初探

【目的】初步探讨小檗碱(Berberine,Ber)和胰岛素样生长因子I (Insulin like growth factorI,IGF-I)对猪体外受精胚胎发育效果的作用。【方法】通过在NCSU-23基础培养液中添加IGF-I (50、100、150ng/mL),筛选出最佳质量浓度;以添加Ber (0.1μg/mL,Ber组)、最佳质量浓度的IGF-I (IGF-I组,100ng/mL)和同时添加二者(Ber+IGF-I组)为三个试验组,观察猪体外受精胚胎的发育效果,并检测各组别IGF-I、IGF-IR(Insulin-like growth factor I recepter,胰岛素样生长因子I受体)转录水平。【结果】IGF-I 100、150ng/mL组胚胎各时期发育率均极显著高于对照组和50ng/mL组(P<0.01),100ng/mL与150ng/mL组之间无显著差异(P>0.05),最佳质量浓度为100ng/mL;Ber组、IGF-I组、Ber+IGF-I组胚胎各时期发育率、IGF-I、IGF-IR转录水平均极显著高于对照组(P<0.01),但三组之间均无显著差异(P>0.05)。【结论】Ber和IGF-I可显著提高猪体外受精胚胎发育率,提高其内源性IGF-I、IGF-IR基因转录水平,但同时添加二者与单独添加相比并无显著变化,推测二者可能参与介导同一个信号通路,有待进一步研究。

固醇调节元件结合蛋白1干扰片段/激动剂浓度对猪卵母细胞体外发育效果的影响

【目的】观察并筛选固醇调节元件结合蛋白1干扰片段和激动剂浓度对猪卵母细胞体外成熟的作用。【方法】以猪卵母细胞体外成熟22 h未显微注射为对照组,显微注射阴性片段为阴性对照组,显微注射固醇调节元件结合蛋白1干扰片段(固醇调节元件结合蛋白1-Sus-756、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-837、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-1104)分别为固醇调节元件结合蛋白1-Sus-756组、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-837组和固醇调节元件结合蛋白1-Sus-1104组,显微注射50、75、100、125、150和175 nmol/L固醇调节元件结合蛋白1激动剂分别为50、75、100、125、150和175 nmol/L组,将各组进行体外成熟的卵母细胞体外受精,观察2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚率。【结果】固醇调节元件结合蛋白1-Sus-1104较固醇调节元件结合蛋白1-Sus-756、固醇调节元件结合蛋白1-Sus-837显著降低了猪卵母细胞体外成熟和体外受精囊胚发育率(P<0.05),125 nmol/L固醇调节元件结合蛋白1激动剂较其他各浓度组显著提高了猪卵母细胞体外成熟率和体外受精囊胚发育率(P<0.05)。【结论】固醇调节元件结合蛋白1-Sus-1104干扰片段和125 nmol/L固醇调节元件结合蛋白1激动剂对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎的发育效果具有显著影响。

小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及胚胎发育的影响

【目的】探讨小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及体外受精胚胎发育效果的影响。【方法】体外成熟液和胚胎培养液中添加小檗碱为Ber组,未添加小檗碱为对照组,MII期卵母细胞进行冷冻液处理为冷冻液处理对照组和冷冻液处理+Ber组;采用开放式拉长塑料细管法对卵母细胞玻璃化冷冻与解冻,试验各组别为GV期冷冻组、GV期冷冻+Ber组、MII期冷冻组、MII期冷冻+Ber组。观察卵母细胞体外成熟效果及其体外受精胚胎体外发育效果;观察卵母细胞冷冻化学损伤存活率及其体外受精胚胎发育率;采用尼罗红染色法观察卵母细胞中脂滴含量,观察卵母细胞玻璃化冷冻解冻后存活率及其体外受精胚胎发育率;利用差异染色法和TUNEL法计数囊胚内细胞团和细胞总数以及细胞凋亡数。【结果】Ber组能够极显著促进猪卵母细胞体外成熟,显著降低猪卵母细胞玻璃化冷冻的化学损伤,促进猪卵母细胞冷冻解冻后的细胞存活率,而猪MII期卵母细胞相对于GV期卵母细胞具有很好的冷冻解冻后的存活率;小檗碱能降低猪卵母细胞玻璃化冷冻后的脂滴含量,MⅡ期卵母细胞冷冻前后脂滴含量均低于GV期冷冻前后;小檗碱能够促进猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后的体外成熟,且有利于猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后早期胚胎的发育,相对于冷冻MII期卵母细胞,冷冻GV期卵母细胞具有更好的体外发育效果;小檗碱能够提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外发育囊胚内细胞团数与细胞总数,降低其细胞凋亡,有利于提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外受精胚胎发育至囊胚的质量。而GV期相对MII期则冷冻效果更佳。【结论】小檗碱能够通过降低玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量,从而提高其冷冻解冻后体外成熟率和体外受精胚胎发育质量;GV期玻璃化冷冻卵母细胞相对于MII期,在冷冻解冻后其体外受精胚胎发育质量有更好提高。相关机制还有待今后进一步研究。

小檗碱和miRNA-18b对猪IVF胚胎HIF-1α的调控作用

【目的】探明miRNA-18b和HIF-1α之间的关系。【方法】以NCSU-23胚胎培养液为对照组,Ber加入NCSU-23培养液中为Ber组,在对照组的原核胚细胞质中显微注射10pLmiRNA-18b过表达剂(agomir)、低表达剂(antagomir)和阴性片段分别为miRNA-18bagomir组、miRNA-18bantagomir组和阴性片段对照(NC)组。观察IVF胚胎2-、4-、8-细胞和桑椹胚、囊胚发育率;通过qRT-PCR、Western-blot和双荧光素酶报告基因的方法验证miRNA-18b的靶基因HIF-1α。【结果】Ber组和miRNA-18bantagomir组,可极显著提高猪IVF囊胚发育率(P<0.01)。Ber组和miRNA-18bantagomir组能上调猪IVF胚胎中HIF-1α表达水平,miRNA-18b agomir组能下调HIF-1α表达水平;HIF-1α的表达水平随着胚胎发育呈上升趋势,4-~8-细胞阶段更为明显;在HIF-1α的3’UTR wt、mut重建载体转染产生的双萤光素酶活性上,miRNA-18b与NC组均无差异(P>0.05)。【结论】Ber和抑制miRNA-18b的表达能够促进4-、8-细胞和桑椹胚时期HIF-1α的表达从而促进猪IVF胚胎体外发育,其中4-~8-细胞时期作用更为明显。