发育性内皮基因座-1在人冠状动脉粥样硬化斑块中的表达及其与冠心病的关系

目的 检测发育性内皮基因座-1(DEL-1)在人冠状动脉粥样硬化斑块中的表达,探讨其参与冠心病(CHD)发生发展的相关机制。方法 将58例人冠状动脉标本分为CHD组(25例)和对照组(CON组,33例),以左前降支作为研究对象;通过HE染色检测冠状动脉内膜厚度、纤维帽厚度、管腔狭窄程度评价冠状动脉结构改变;Western blot法检测冠状动脉内DEL-1、白细胞介素-17(IL-17)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)及CCAAT增强结合蛋白β(C/EBPβ)的表达水平;免疫组织化学染色方法检测DEL-1、GSK-3β、C/EBPβ及IL-17在动脉粥样硬化斑块内的细胞分布及表达水平;Pearson积矩相关系数检验分析DEL-1表达水平与冠状动脉形态结构变化之间的相关性。结果 HE结果显示,与CON组相比,CHD组血管内膜增厚、管腔狭窄程度增大、纤维帽厚度变薄(P<0.05);免疫组织化学染色显示,CHD组中DEL-1主要表达在斑块内泡沫细胞胞质及胞核,而IL-17、GSK-3β及C/EBPβ主要在胞质中表达;Western blot结果显示,与CON组比较,CHD组中DEL-1、IL-17、GSK-3β、p-GSK-3β、C/EBPβ表达水平升高(P<0.05);Pearson积矩相关系数结果显示,DEL-1的蛋白表达水平与血管内膜厚度、管腔狭窄程度呈正相关(r=0.693、0.733,P<0.05),与纤维帽厚度呈负相关(r=-0.432,P<0.05)。结论 DEL-1在人动脉粥样硬化斑块内表达增加,其可能通过GSK-3β/C-EBPβ通路调节斑块内炎症反应,从而参与CHD的发生发展。

基于双硫死亡的心肌缺血再灌注损伤相关风险基因筛选及分析

目的:筛选基于双硫死亡的心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)相关风险基因及探索其可能的作用途径。方法:用R语言limma分析并筛选MIRI相关风险基因24 h组与Control组之间的差异表达基因。基于GO和KEGG数据库利用R语言cluterProfiler包对其进行功能富集分析。根据双硫死亡基因集以及GSE160516的表达数据,利用R语言GSVA包中的ssgsea法对其进行富集分析,并利用Venn图获得心肌缺血再灌注中双硫死亡相关基因的表达。用R语言psych包中的corr.test计算双硫死亡相关基因与凋亡因子、线粒体、铁死亡及炎症等相关基因的相关性,并绘制热图。利用R语言Mfuzz包来进行不同时间点心肌缺血再灌注转录组数据的表达模式聚类分析并利用Venn图获取时序性差异表达的双硫死亡基因。结果:本研究共筛选出17个差异表达双硫死亡相关基因,经过双硫死亡相关基因与炎症、凋亡、铁死亡、线粒体基因相关性分析,以及双硫死亡相关基因与心肌缺血再灌注时序性分析的差异表达基因筛选,最终得到双硫死亡相关基因Flna、Myl6、Tln1在MIRI不同时间的特异性表达。结论:Flna、Myl6、Tln1在MIRI中可能起着关键作用,其基于双硫死亡同时与线粒体相关基因密切相关,可作为MIRI患者风险因素的筛选指标。

人冠状动脉内膜增厚与核因子-κb信号通路激活的相关性

目的探讨人冠状动脉内膜增厚与核因子-κb(NF-κb)信号通路激活的相关性。方法收集尸检案例的冠状动脉标本45例,分为对照组(CON组,非冠心病死亡并无明显动脉粥样硬化者)16例、冠心病组(CHD组,非冠心病猝死但明确诊断为冠心病患者)组10例、冠心病猝死组(SCD组,冠状动脉粥样硬化性心脏病猝死者)19例,采用苏木精-伊红(HE)染色观察3组冠状动脉的组织学特征,采用免疫荧光技术检测3组冠状动脉内膜处磷酸化NF-κb p65(NF-κb p-p65)入核数量百分比并测量冠状动脉内膜厚度,采用Pearson相关系数检验分析NF-κb p-p65入核数量百分比与冠状动脉内膜厚度的相关性。结果CON组冠状动脉标本内膜厚度低于CHD组及SCD组;与CON组比较,CHD组和SCD组冠状动脉标本冠脉内膜处NF-κb p-p65蛋白的入核百分比增高(P<0.05),并与冠状动脉内膜的厚度呈正相关关系(r=0.345,P<0.05)。结论人冠状动脉内膜增厚与内膜处NF-κb信号通路激活的水平存在正相关。

猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的原核表达及免疫学研究

目的通过对猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的表达,对其免疫性进行初步研究。方法利用生物信息学从猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出谷胱甘肽转移酶(GST)基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+),经过双酶切、PCR鉴定后,异丙基-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析,Western blotting鉴定该蛋白免疫反应性。结果成功构建了重组体,并得到高纯度蛋白,该蛋白可被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别。结论猪带绦虫谷胱甘肽转移酶可在原核系统中获得具有免疫反应性的高效表达。

“雨课堂讨论区”在“人体寄生虫学”实验教学中的应用初探

为提高“人体寄生虫学”实验教学质量,将基于雨课堂讨论区模块的实验教学模式引入“人体寄生虫学”教学中,通过对该模块的使用,我们发现学生能够更加积极参与讨论,提出问题和分享自己的经验。此外,讨论区也促进了学生之间的交流和合作,增强了他们的团队意识。同时,教师也能够更加及时地了解学生的学习情况和需求,为他们提供针对性的指导和支持。因此,我们认为“雨课堂讨论区”是一种有效的教学工具,可以提高学生的学习效果和教学质量。

猪带绦虫腺苷酸激酶的克隆及其重组蛋白免疫反应性的评价

为原核表达猪带绦虫腺苷酸激酶(ADK),对其免疫性进行初步研究,本研究以猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中ADK同源基因重组质粒为模板,通过PCR扩增并将其亚克隆于原核表达载体pET28a(+),构建了pET-Ts-ADK重组质粒,经IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE鉴定,表明重组蛋白约30ku。经His-镍蛋白纯化柱纯化后western blot试验表明该重组蛋白可被猪带绦虫、亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明猪带绦虫ADK基因在原核表达系统中表达获得的蛋白具有免疫反应性。

牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及EST测序

目的构建牛带绦虫(Taeniasaginata)成虫全长cDNA质粒文库,为寻找更多有效的牛带绦虫病疫苗候选抗原分子及对三种主要人体带绦虫的功能基因对比研究奠定基础。方法提取牛带绦虫成虫mRNA;进行反转录合成双链cD-NA。PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,进行SfiI酶切;用CHROMA SPIN-400柱将酶切产物进行分级分离,经1.1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并与改造载体pBluescript Ⅱ SK连接,将连接产物涂板,测定文库的滴度;用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建文库质量。随机挑选质粒文库转化的阳性重组克隆,进行较大规模的5′端测序,归并UniGene。结果测定文库的滴度为1016个菌落/μL,共测1023个克隆,对这些序列进行UniGene归并,得到419条unigene。结论已成功获得高质量的牛带绦虫成虫全长cDNA表达文库。

亚洲带绦虫膜联蛋白B2基因的表达、纯化及免疫学分析

目的对亚洲带绦虫膜联蛋白B2(Annexins B2)进行克隆表达及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出Annexins B2基因,并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用Western blotting进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及重组质粒DNA测序均显示重组体构建成功,并得到高纯度的蛋白,且该重组蛋白可被亚洲带绦虫、猪带绦虫及牛带绦虫患者的血清识别。结论亚洲带绦虫成虫Annexins B2基因可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达。

人类CX40基因生物信息学分析及其法医学研究意义

目的利用生物信息学方法分析和预测人类CX40(connexin 40)全长基因及其编码蛋白的结构和功能特征,用于指导其生物学功能的实验研究,并探索其在法医学猝死案例中研究的应用前景。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士的生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY)中相关的基因、蛋白的序列和结构信息以及各种分析工具,分析该基因的结构并预测其编码蛋白质的结构和功能特征等。结果该基因全长1077bp,编码358个氨基酸,含有四个跨膜区,其理论分子量为40380.3Da,具有较稳定的理化性质。结论应用生物信息方法分析人类CX43基因的功能和结构,有法医学意义。

猪带绦虫乳酸脱氢酶基因的序列分析、克隆表达和免疫学分析

目的利用生物信息学方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中识别乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDH-A),分析和预测其编码蛋白的结构和功能,并对其进行克隆表达和免疫学特性研究。方法利用NCBI和ExPASy中有关基因、蛋白的序列和结构信息分析工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别乳酸脱氢酶A(TsLDH-A)的基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白的结构与功能;并将TsLDH-A克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中诱导表达,表达产物经纯化后用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果该基因全长1 332bp,编码331个氨基酸。其氨基酸序列与其它物种LDH-A氨基酸序列一致性可达54%,具有乳酸脱氢酶保守结构域。其编码的蛋白理论分子量为3 5461.1Da,有3个跨膜区和多个磷酸化位点,蛋白的理化性质较稳定。预测有4个主要的B细胞抗原表位,L-乳酸脱氢酶活化位点之一的His192包含于表位190-199aa中。酶催化位点的3个关键氨基酸在空间结构上相互靠近。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-TsLDH-A构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白能被TsLDH-A重组蛋白免疫的SD大鼠血清、感染了猪带绦虫的病人血清及猪血清识别,表明其具有较好的免疫原性和免疫反应性。结论应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了TsLDH-A的全长序列并预测得到其编码蛋白的结构与功能方面的信息,该基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达。

大头金蝇卵不同发育时间形态变化及基因表达差异研究

目的 研究大头金蝇（Chrysomya megacephala）卵不同发育时间的形态变化和基因表达差异规律。方法 从大头金蝇成虫产完卵后,取出卵块,记时为0 h,每隔2 h取卵10枚,直至有幼虫孵出,分别用体视显微镜和扫描电镜观察其不同发育时间的形态学变化。提取0、2、4、6和8 h等5个发育时间点的蝇卵RNA,应用RT-PCR比较循环阈值（threshold cycle,CT值）法测定bicoid、slalom和几丁质合成酶（chitin synthase）基因相对表达水平,SPSS19.0统计学软件对CT值及时间进行拟合直线方程、等比级数曲线方程和指数方程分析。结果 体视显微镜下观察,大头金蝇卵产后0～4h形态学变化不明显,6h有体节形成,8 h开始出现皱缩,9 h有幼虫孵出;扫描电镜下观察,卵产后0～4 h时变化不明显,卵孔一端略向外突出,卵孔周围光滑,6 h后卵孔一端向内凹陷,卵孔周围有不规则突起形成,8 h时凹陷明显,9 h已发育为幼虫。大头金蝇卵在不同发育时间bicoid、slalom和chitin synthase等3个基因的相对表达水平随着时间变化呈一定的规律变化,相关回归方程式3个基因CT值的差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 体视显微镜和扫描电镜下大头金蝇卵形态结构随时间改变而发生变化。大头金蝇卵不同发育时间的bicoid、slalom和chitin synthase基因表达水平有差异。

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其蛋白质结构与功能的生物信息学分析

目的分析和预测亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其编码蛋白的结构与功能特性,用于指导其生物学功能的实验研究。方法利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,如VectorNTIsuite,从亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库中识别出泛素缀合酶基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构等。结果该序列为全长基因,编码区为76bp-537bp,编码154个氨基酸。该序列为泛素缀合酶基因同源序列。其编码蛋白的理论分子量为17397.1,亚细胞定位在细胞核。预测该蛋白无跨膜区。与吸虫属的泛素缀合酶进化关系最近。结论应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了亚洲牛带绦虫泛素缀合酶cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面的信息。

亚洲带绦虫烯醇化酶基因的原核表达、鉴定与组织定位

目的表达亚洲带绦虫(Taenia asiatica,Ta)成虫烯醇化酶(enolase,ENO)基因,并对其进行组织定位和免疫反应性分析。方法通过大规模测序从亚洲带绦虫cDNA文库中确定ENO基因,PCR扩增目的片段,将其克隆至表达质粒pET-30a(+),在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化重组蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组蛋白的免疫反应性。将重组蛋白免疫SD大鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体水平,间接免疫荧光检测确定ENO在亚洲带绦虫成虫组织中的定位。结果PCR、双酶切和DNA测序结果均表明,重组质粒pET-30a(+)-TaENO构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白TaENO的相对分子质量(Mr)为47000。经亲和层析获高纯度的蛋白,蛋白浓度为0.37mg/ml。重组蛋白TaENO能被SD大鼠抗血清、感染亚洲带绦虫的猪血清和患者血清识别。间接免疫荧光检测结果显示,TaENO主要定位于成虫的表膜。结论纯化后的亚洲带绦虫成虫烯醇化酶重组蛋白具有较强的免疫反应性,烯醇化酶主要定位于成虫表膜。

贵阳地区常见嗜尸性蝇类丽蝇科DNA条形码的构建

目的:构建贵阳地区常见嗜尸性蝇类丽蝇科的系统发育树。方法:对家兔尸体上采集到的嗜尸性蝇类丽蝇科的卵、幼虫及成虫提取DNA,扩增COI基因条形码区的序列,采用CLC Sequence View、MEGA软件进行序列分析,构建系统发育树。结果:共采集到丽蝇科5属9种嗜尸性蝇类,经序列测定确定各样本的形态学鉴定与分子鉴定是符合的,并以此序列构建出贵阳地区常见嗜尸性蝇类丽蝇科的系统发育树。结论:可以利用COⅠ基因条形码区序列构建的系统发育树进行贵阳地区嗜尸性蝇类的种属鉴定。

猪带绦虫CDC37基因的克隆、表达与组织定位研究

目的原核表达猪带绦虫(Taeniasolium)细胞分裂周期蛋白37(cell division cycle 37,TsCDC37),并对其进行组织定位和免疫原性研究。方法通过Blastx分析从猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出TsCDC37基因,PCR扩增CDC37基因,以pET-28a(+)为载体构建目的基因原核表达体系,在大肠埃希菌(E.coli)BL-21/DE3中诱导表达,纯化的重组蛋白免疫SD大鼠制备免疫血清,Western blotting分析重组蛋白的免疫原性,免疫组织化学方法观察TsCDC37在猪带绦虫成虫中的组织定位。结果 PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pET-28aTsCDC37构建成功。目的基因在BL-21/DE3菌株中得到稳定表达,重组蛋白的相对分子质量(M_r)为52 000。纯化的重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清和猪带绦虫病、亚洲带绦虫病或牛带绦虫病患者血清识别。免疫组化结果显示,TsCDC37分布于猪带绦虫成虫表膜和子宫中的虫卵。结论纯化后的猪带绦虫细胞周期分裂蛋白TsCDC37具有较强的免疫原性,主要定位于猪带绦虫成虫的表膜和子宫中的虫卵。

2009—2011年上海市黄浦区中心医院中药注射剂应用分析

目的:了解我院中药注射剂的临床使用情况,探讨中药注射剂的合理使用问题,为临床合理用药提供参考。方法:对2009—2011年我院住院患者使用中药注射剂的销售金额、用药频度(DDDs)、限定日费用(DDC)等进行分析。结果:我院中药注射剂中祛瘀类和抗肿瘤药销售金额和DDDs排序均居前列,符合我院老年患者心血管疾病多发和乳腺特色专科乳腺肿瘤居多的特点。结论:我院临床中药注射剂使用基本合理,但部分药品销售金额与DDDs同步性差,临床使用时应重视中药注射剂的使用剂量,合理使用中药注射剂。

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2的克隆表达及免疫鉴定

目的克隆表达亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2(UBCE2)全长编码序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做充分准备。方法以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含有UBCE2基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,并使用Western blotting分析其免疫反应性。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-UBCE2构建成功,该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达,十二烷基肌氨酸钠纯化后蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠杆菌BL-21/DE3得到高效表达,亲和层析得到高纯度的蛋白且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明其有免疫反应性。结论亚洲牛带绦虫UBCE2可在原核表达系统中表达,并具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能奠定基础。

猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫学分析

目的对猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase,MDH)进行克隆,表达及免疫学特性的初步研究。方法将猪带绦虫MDH基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙基--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blot)进行免疫学分析。结果成功构建pET-28a(+)-MDH重组质粒,并获得高纯度蛋白,该重组蛋白可被其免疫SD大鼠血清识别,同时也能被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别。结论猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因(TaRPL8),探索其应用前景。方法用RT-PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPL8基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPL8基因可在大肠埃希菌BL21/DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。