赖型钩体DNA重组质粒rpDJt及其表达蛋白P68对豚鼠的免疫保护研究

为了进一步鉴定赖型钩体ＤＮＡ重组质粒ｒｐＤＪｔ及其纯化表达蛋白质Ｐ６８的免疫保护作用，采用随机、双盲和对照法对５０只豚鼠进行了３次和６个部位主动免疫接种，并于接种后３０天以强毒力、大剂量活钩体攻击。结果：Ｐ６８组存活率１００％（７／７）；ｒｐＤＪｔ组存活率７７％（１０／１３）；ｐＴ７－７组（无重组质粒）存活率２５％（３／１０）；全钩灭活疫苗组存活率９３％（１３／１４）。作者认为该质粒的表达蛋白质Ｐ６８可作为钩体基因工程亚单位疫苗的候选抗原。

赖型钩体pD C 38核酸序列测定及其与流感伤寒型钩体外膜蛋白基因om pL 1核酸序列的类似性匹配

为了探讨赖型钩体 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段基因组 Ｄ Ｎ Ａ 编码、位置与ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因的关系，作者采用在流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ｏｍ ｐ Ｌ１ 首尾区段设计一对引物，以 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段作模板进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增、测定和类似性匹配（ａｌｉｇｎｍ ｅｎｔ）。结果发现：ｐ Ｄ Ｃ３８ 含有 ２．７ｋｂ 和３．０ｋｂ 两个插入片段，３．０ｋｂ 片段含有 １ 个ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因全拷贝。结论：类似性匹配表明，ｐ Ｄ Ｃ３８ 和ｏｍ ｐ Ｌ１ 相同碱基８６４ 个（９０％ ），碱基变异（不配对）９６（１０％ ）个， ｐ Ｄ Ｃ３８ 可用于钩体诊断、分类、鉴定、疫苗和发病机理的研究。

赖型钩体flaB2与VR1012中的CpG基序分析

目的 对问号赖型钩端螺旋体 (赖型钩体 ) DNA疫苗〔包括内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )和质粒 DNA表达载体 (VR10 12 )〕的 Cp G基序 (Cp G motifs)进行分析 ,为 DNA疫苗免疫机制的阐明和提高 DNA疫苗的效能奠定基础。方法 以 fla B2与 VR10 12构建重组 DNA的免疫原 ,对 fla B2及 VR10 12全核苷酸序列进行计算机分析 (分类、计数和定位 )。结果 Cp G的“C”的侧翼为两个嘌呤 ,“G”的侧翼为两个嘧啶 ,在 fla B2中共 3个 ,分别为GACGCT,GACGTC和 GACGCC;在 VR10 12中共 11个 ,分别为 GACGTC1个 ,GACGCT2个 ,GACGCC1个 ,GACGTT1个 ,GGCGTT2个 ,GGCGCT2个 ,GGCGCC1个 ,AACGCT1个 ,其中特别重要的 TGACGTCA4个和 TAACGCCA有 1个 ,位于 5′端 4 5 6～ 4 6 3;5 0 9～ 5 16 ;5 92～ 5 99;778～ 785和 4 86～ 4 93;4个 TGACGTCA和 1个TAACGCCA均位于 5′端且相对集中。结论 赖型钩体 fla B2与 VR10 12构成的 DNA疫苗含有 TGACGTCA等Cp G,这些基序又称免疫刺激序列 ,构成了

赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因的体外扩增、分子克隆、核苷酸序列分析及其编码33kDa内鞭毛蛋白对BALB/c小鼠的兔疫/保护作用

戴保民教授于1986年任博士导师,1981～1987年任卫生部医学科学委员,1986～1993年任国际细菌学会钩端螺旋体命名委员会协作委员,1992～1997年任卫生部自然疫源性疾病专家咨询委员,1990年获卫生部科技进步一等奖,1992年获国家科技进步三等奖。

四川省钩端螺旋体病肺弥漫性出血抢救及其主要病原体赖型钩端螺旋体的独特性

钩端螺旋体病(以下简称钩体病)是四川省常见病之一,发病时间集中在秋收季节,农民因下田劳动受染,1980～1989年呈现暴发流行达94县次。肺弥漫性出血(以下简称PDH)是导致四川省钩体病患者死亡的主要原因,占该病死因的98％。经过多年现场观察发现PDH的发生发展有严格规律性,独特的临床征象和病理变化,是一种国内外文献未系统报道过的一种临床病理实体(Special clinico-pathological entity)。通过乐山市几个县长期现场研究,及实验室研究,发现PDH是由数量多、毒力强、致病力大的钩体引起的,在四川、贵州、湖南。

我国山丘疫区与平原疫区利什曼原虫分离株分子核型分析

目的：分析我国山丘疫区和平原疫区利什曼原虫分离株分子核型。方法：脉冲场电泳。采用１％琼脂糖凝胶，电压６Ｖ／ｃｍ，０．５×ＴＢＥ，１４℃，脉冲时间６０ｓ，电泳１５ｈ和脉冲时间９０ｓ，电泳９ｈ。结果：各个分离株均分离出分子量范围在２００ｋｂ－２２００ｋｂ的ＥＢ染色条带为１５条左右，其中６个山丘疫区分离株之间的核型相似，且犬株与人株的亦相似，并与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ的核型接近；２个平原疫区分离株之间的核型相似；山丘疫区与平原疫区分离株之间的核型不同。结论：山丘疫区分离株之间和平原疫区分离株之间均各自存在着同源性，山丘疫区分离株与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ之间存有部分同源性，但两个疫区分离株之间存在着异源性；保虫宿主——家犬，是我国山丘疫区内脏利什曼病的重要传染源。

一种钩端螺旋体DNA疫苗的免疫原性和免疫保护性研究

为了研究赖型钩体内鞭毛蛋白基因在动物体内的表达及其免疫保护性，采用ＰＣＲ扩增内鞭毛蛋白编码基因，以表达质粒ＶＲ１０１２为载体，构建了含有钩体的内鞭毛基因的重组质粒。在新西兰大白兔四头肌内注射该重组质粒ＤＮＡ５００μｇ／只，重复３次，每次间隔３周，于每次注射前和末次注射后３周，检测血清抗赖型钩体抗体效价。结果显示：在第１次加强免疫注射后３周，试验组血清抗体效价显著增高。豚鼠免疫保护试验表明，该ＤＮＡ重组质粒有明显免疫保护作用，在无佐剂条件下试验组存活率为９０％（９／１０只）。本研究为钩体核酸疫苗研制奠定了基础。

钩端螺旋体病患者血标本的快速处理及PCR检测

本文利用二氧化硅──高盐吸附法及１６ＳｒＲＮＡ基因特异性引物对钩端螺旋体病患者早期血标本进行了快速处理及检测，经反复试验表明，该方法简便、快速、稳定、敏感，对钩体病的流行病学研究及临床早期诊断有一定的价值。

兔中性粒细胞抗菌肽的纯化和鉴定

作者用0.01 mol/L柠檬酸提取家兔中性粒细胞溶酶体可溶性成份,经制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从提取物中纯化出5种肽(NP_1、NP_2、NP_3、NP_4、NP_5),它们的分子量在2500～6000之间,体外杀白色念珠菌试验证实,NP_1、NP_2有高效杀菌活性,NP_3也有较强的杀菌活性。

问号状钩端螺旋体外膜单克隆抗体凝集反应特性的研究

作者用黄疸出血群赖型钩体外膜免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP 2/0骨髓癌细胞融合,筛选出三株抗问号状钩体外膜 McAb。显凝试验(MAT)表明 McAb的E4B11C9株与选用的黄疸出血群的13型钩体(占选用的100％)均发生凝集反应,而选用的其他18群钩体(占选用的100％)和非致病性Patoc Ⅰ株钩体,伊利尼细螺旋体均为MAT阴性,MAT效价低于1:25。从而证明 E4B11C9 McAb具有黄疸出血群钩体的群特异性。

赖型钩体重组质粒pDJH_2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为钩体重组疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别与ｐＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化入大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达。结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ．ｐＤＪｒＢ１能在大肠杆菌中高效表达；对其进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可见６８ｋｄ和２３ｋｄ处出现新带，与钩体０１７株外膜同分子量蛋白带位置一致，免疫印迹（特异性抗０１７株外膜抗血清）在６８ｋｄ和２３ｋｄ处分别有印迹；用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强毒力株攻击，表现出免疫保护作用。本实验结果提示：（１）ｐＤＪＨ２１．９ｋｂ重组ＤＮＡ片段能以不同质粒为载体，在不同大肠杆菌株中高效表达；（２）该重组ＤＮＡ片段表达产物——６８ｋｄ和２３ｋｄ蛋白，可能是赖型钩体０１７株外膜的保护性抗原。

问号赖型钩体重组质粒rpDJt表达蛋白P68免疫原性的研究

为构建一种新型钩体重组亚单位疫苗，采用问号钩体ｒｐＤＪｔ基因的蛋白表达物Ｐ６８免疫动物，对其免疫原性进行研究。结果显示：在体外，Ｐ６８能与其特异性抗血清及赖型钩体死菌苗抗血清呈明显高效价Ａｇ－Ａｂ反应；在体内，Ｐ６８能激起明显的Ｔ淋巴细胞转化，ＴＨ细胞活化，ＩＬ－２，ＩＬ－６活性增加。提示：ｒｐＤＪｔ表达蛋白Ｐ６８能激起机体强有力的Ｔ－Ｂ细胞协同性特异性体液免疫反应，是致病性强毒力钩体重组亚单位疫苗好的候选抗原之一。

赖型钩体内鞭毛基因的扩增、克隆、核苷酸序列测定及其在大肠杆菌中的表达

根据钩体内鞭毛蛋白（Ｅｎｄｏｆｌａｇｅｌｌｉｎ）ｆｌａＢ基因核苷酸序列自行设计一对引物，以赖型钩体ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ扩增到约８４０ｂｐ的片段。扩增片段经酶切（ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ）定向克隆入ｐＵＣ８。重组质粒ｐＬＦ１插入片段与哈勒焦型钩体ｆｌａβ基因相比，核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性很高。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明有一约３３ｋｄ的特异蛋白带，表达量占菌体蛋白１１％。免疫印迹试验表明此区带能被抗赖型钧体内鞭毛（轴丝）抗血清识别。首次以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠钧体病模型为基础，用含重组质粒ｐＬＦ１的大肠杆菌作免疫原进行免疫保护试验，实验组存活率高子对照组，表现了一定程度的保护作用。本研究结果在所查国内外文献中尚属首次报道。

我国新疆皮肤利什曼病病原体SSU rDNA多变区序列分析

我国新疆皮肤利什曼病病原体（ＣＬＰ）种株鉴定尚有分歧。本研究用一对利什曼原虫属特异引物Ｒ２２２和Ｒ３３３，直接从皮肤利什曼病病人皮肤病变组织、热带利什曼原虫（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｔｒｏｐｉｃａ）和婴儿利什曼原虫（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）基因组ＤＮＡ中扩增出一ＳＳＵｒＤＮＡ特异片段，克隆到ｐＧＥＭ○Ｒ－ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ上，并以双脱氧链末端终止法测序。序列分析显示扩增的ＣＬＰ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａＳＳＵｒＤＮＡ序列皆为３９１ｂｐ长，Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ与ＣＬＰ的序列之间３８７个碱基相同，存在４个点突变；Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ与ＣＬＰ的序列之间３８３个碱基相同，存在７个点突变和２个移码突变；Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ的序列之间３８７个碱基相同，存在３个点突变和２个移码突变。表明扩增的ＣＬＰ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａＳＳＵｒＤ－ＮＡ多变区序列高度同源，但仍存在少数点突变，或插入／缺失；该ＳＳＵｒＤＮＡ序列变异可反应种间差异；新疆皮肤利什曼病病原体与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ较相近。

重组钩体基因疫苗免疫豚鼠脾细胞LTT,IL-2,IL-6的活性测定

目的 为从多方面证实赖型钩体重组基因疫苗的免疫活性。方法 将赖型钩体重组基因多肽疫苗 (分子量6 8k Da)多点皮下注射免疫豚鼠。(以质粒载体 p T7- 7为阴性对照 ,全钩死疫苗 WCV为阳性对照 )取其脾细胞 ,用 3H- Td R法和MTT比色法分别测定特异性淋巴细胞转化试验 (L TT)的相对转化指数 (RPI)及 IL - 2 ,IL - 6活性。结果 1)重组基因疫苗免疫组特异性 L TT的 RPI为 2 .19± 0 .18明显高于 p T7- 7阴性对照 1.42± 0 .2 7(P<0 .0 0 5 ) ,与阳性对照 WCV无统计学差异 (P>0 .0 5 )。2 )基因疫苗免疫组 IL - 2 ,IL - 6活性分别为 34.8± 3.11,94.6± 6 .0 2测定值明显高于 p T7- 7阴性对照 2 0 .4± 3.0 5 ,6 1±6 .2 8(P<0 .0 0 5 ) ,与 WCV阳性对照无统计学差异 (P>0 .0 5 )。结论 1)钩体基因重组疫苗能使免疫豚鼠体内 Th1 、Th2 活化增强 ,有胸腺依赖性抗原性质 (TDAg) ,可激起体内强有力 T- B细胞协同效应的特异性体液免疫反应 ,确有增强免疫活性作用 ,是良好的免疫原。2 )重组钩体基因疫苗与阳性对照 WCV各实验值无统计学差异 ,提示二者免疫活动可能相当 ,但重组基因疫苗有毒副作用小的优势 。

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建

目的 为增强问号赖型钩端螺旋体 (钩体 0 17株 ) DNA疫苗内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )与外膜抗原基因 (omp L1 )的免疫保护作用 ,构建一种能表达 fla B2 与 om p L1 蛋白融合蛋白的 DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增 0 17钩体 fla B2 与 omp L1 片段并进行融合 ,获得的嵌合基因 om p L1 - fla B2 中含有 10个氨其酸的中间接头序列 ,以维持其空间构象。结果 经酶切鉴定 ,证实有一 1.8kb片段插入载体 ,其 fla B2 及 om p L1 DNA测序结果与文献报道的一致。结论 表达 0 17株钩体 fla B2 与 om p L1 抗原融合蛋白的

问号赖型钩体重组质粒pDJH_2 DNA 序列测定及其与其它细菌omp基因序列比较分析

对ｐＤＪＨ２片段ＤＮＡ进行了序列测定，结果：插入片段为１８１１个核苷酸；可读框２个：ＯＲＦ１，１－５６５ｂｐ；ＯＲＦ２（从最后一个密码倒算）１－６６２ｂｐ，计算机序列同源性或类似性匹配（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）表明，ＯＲＦ１与ＯＲＦ２的核苷酸类似性为４９．３６％；ＯＲＦ１与Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ（Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ）流感伤寒型ｏｍｐ核苷酸序列类似性为４９．２６％；ＯＲＦ２与Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ类似性为５１．５６％；ＯＲＦ１与其它细菌（包括螺旋体）ｏｍｐ核苷酸序列对准比较，序列类似性均在４３％以上。经查阅ＥＭＢＬＤＮＡ序列数据库未见类似序列。作者认为ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ插入ＤＮＡ片段（ＯＲＦ１与ＯＲＦ２）可能是具有保护作用的ｏｍｐ基因片段。

钩体017株基因库pDJH_2与L．alstoni重组DNA探针同源性及pDJH_2在大肠杆菌中表达产物的分析

用地高辛标记含完整ＯｍｐＬ１结构基因之Ｌ．ａｌｓｔｏｎｉ２．５ｋｂＥｃｏＲ１重组ＤＮＡ探针与我们构建的赖型钩体０１７株基因库重组质粒ｐＤＪＨ＿２进行ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交。结果显示：该重组ＤＮＡ探针与ｐＤＪＨ＿２１．９ｋｂ插入片段同源；使用ＩＰＴＧ诱导重组质粒ｐＤＪＨ＿２后，其在大肠杆菌中表达了６８ｋｄ产物。经蛋白酶Ｋ消化、免疫印迹及斑点一酶联免疫吸附试验，提示此６８ｋｂ产物是蛋内质抗原；用该６８ｋｂ蛋白质抗原主动免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，可抵抗强毒力赖型钩体０１７株的攻击，表现出对小鼠的免疫保护性，从而为赖型钩体０１７株基因工程疫苗的研制奠定了一定基础。此赖型０１７株钩体重组ＤＮＡ经ＩＰＴＧ诱导后能在大肠杆茵中表达，以及其表达产物的保护性动物试验结果，在所查国内外文献中尚属首次报道。

16S rRNA基因多变区序列对不同种属钩端螺旋体的PCR扩增

从问号状钩体16S rRNA基因多变区V2和V4序列中设计了一对引物:PⅠ 5’GGGAAC CTA ATA CTG GAT GG;PⅡ 5’ACA TAG TTT CAA GTG GAG GC,并对不同种属钩体DNA进行了扩增。在55℃退火条件下,问号状钩体各群型具有相同大小的扩增产物(473bp)和KpnⅠ酶谱,双曲钩体有约280bp的扩增带,但不被KpnⅠ酶消化,而细丝体属钩体和其它对照DNA未见扩增。以^(32)P标记的lai型Lai株(强毒)扩增产物作探针行Southern杂交发现,问号状钩体各株扩增带均可被杂交,而双曲钩体扩增物无杂交。研究表明,该对引物可用于钩体的分类和检测。

赖型钩体重组质粒及表达保护性抗原,p68的研究

目的 寻找钩体病基因工程疫苗保护性抗原候选。方法 （１） 鸟枪法构建赖型钩体０１７ 株基因库； （２） α互补、 Ｄ Ｎ Ａ 原位杂交筛选重组质粒； （３） Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交行 Ｄ Ｎ Ａ 同源性分析； （４） 双脱氧链中止测重组 Ｄ Ｎ Ａ 序列及与外膜蛋白基因 （ｏｍｐ） 匹配； （５） Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导重组子表达； （６） 免疫印迹、 Ｍ Ａ Ｔ、 Ｅ Ｉ Ａ、 Ｍ Ｔ Ｔ 检测表达蛋白抗原特性及 Ｉ Ｌ—２ 、 Ｉ Ｌ—６ 活性； （７） 纯化表达蛋白ｐ６８ 进行豚鼠主动免疫 攻击实验， 观免疫保护性。结果 （１） 重组质粒ｐ Ｄ Ｊ Ｈ２ （ 亚克隆ｐ Ｄ Ｊｔ） 插入片段１９ｋｂ ， 与各致病钩体不同片段 Ｄ Ｎ Ａ 高度同源； （２） 序列测定插入片段实际１８１１ｂｐ ， 推测有２ 个读框 （ Ｏ Ｒ Ｆ） ， 各有启动子、终止密码。查 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ｅ Ｍ Ｂ Ｌ 无类似序列； （３） 表达蛋白分子量６８ｋ Ｄ （ｐ６８） ； （４） ｐ６８ 是胸腺依赖性 （ Ｔ Ｄ） 抗原，有良好抗原特性， 抗血清效价１ ： ５２４２８８ ， （ Ｅ Ｉ Ａ） 具很强的动物免疫保护作用。结论 （１） ｐ６８ 编码基因是致病钩体保护性抗原基因； （２） ｐ６８ 是致病钩体外膜保护性抗原，