甜瓜AMS基因结构分析及基因编辑载体构建

【目的】研究鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)的基因家族,分析CRISPR基因编技术并构建其敲除载体,为甜瓜雄性不育基因AMS功能验证提供依据。【方法】采用生物信息学技术鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)家族基因,分析其进化关系、保守基序及理化性质。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以甜瓜AMS基因外显子区设计gRNA引物,以载体pHSN401为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用Bsa I酶切pHSN401载体,利用DNA重组酶构建重组载体并转化农杆菌,挑选单克隆进行培养,随后进行菌液PCR鉴定。【结果】甜瓜AMS基因编码的蛋白质长度从501~605 aa不等,平均分子量约为59351 Da,等电点为5.04~6.45,甜瓜大部分AMS基因定位在细胞核;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在AMS基因的CDS区设计3个靶位点,分别是AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3。【结论】AMS基因主要被预测在细胞核中表达,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建甜瓜敲除重组载体AMS-pHSN401并转化农杆菌,获得阳性克隆。

甜瓜雄性不育系不同发育时期雄蕊转录组分析

从分子水平探讨甜瓜雄性不育雄蕊发育不同时期差异表达基因与花粉败育的相关性,为探究甜瓜雄性不育发生机理提供依据。通过对甜瓜雄性不育系(Male sterile,MS)花蕾(直径为2和5 mm时期)雄蕊进行转录组测序,筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行荧光定量分析。共发现224个差异表达基因,对差异表达基因进行GO功能分析显示,全部基因均归属于生物合成、分子功能和细胞组分3大分支,其中与酶类相关的差异基因为9个,2个差异表达基因为羧酸酯酶同源基因,4个为碳水化合物相关酶类的表达基因,细胞信号传导相关表达基因和玉米素生物合成相关表达基因各1个;qRT-PCR(Quantitative realtime PCR)验证表明,与碳水化合物相关酶类的表达基因和玉米素生物合成相关表达基因在雄性不育株2 mm花蕾雄蕊中的表达量均低于5 mm花蕾雄蕊中的表达量,与细胞信号传导相关表达基因在雄性不育株2 mm雄蕊中的表达量高于5 mm雄蕊中的表达量。雄性不育的发生与能量代谢相关基因表达量的上升和细胞信号传导相关表达基因表达量的减少存在一定的相关性。

甜瓜雄性不育两用系转录组测序与激素含量研究

为了从分子及生理生化水平探讨甜瓜雄性不育发生过程中内源激素(生长素、赤霉素、茉莉酸、水杨酸)与花粉败育的相关性,利用雄性不育两用系对甜瓜可育株与不育株2 mm花蕾雄蕊进行转录组测序,筛选内源激素相关差异表达基因,结合实时荧光定量分析以鉴定差异基因表达量,并对雄性不育株与可育株的花蕾内源激素含量进行测定。结果显示:转录组测序共发现334个差异表达基因,对差异表达基因进行GO功能分析显示,共有273个基因归属于生物合成、分子功能和细胞组分三大分支,其中与内源激素相关的差异基因为7个,其中2个差异表达基因为水杨酸甲基转移同源基因,3个为生长素相关表达基因,赤霉素相关表达基因和茉莉酸相关表达基因各1个;qRT-PCR验证表明,与生长素相关的基因和吲哚-3-乙酸合成相关基因在雄性不育株花蕾中的表达量均高于可育株的表达量,而赤霉素、茉莉酸和水杨酸相关表达基因在雄性不育株花蕾中的表达量则是低于可育株中的表达量。激素含量的测定结果显示赤霉素和生长素含量可育株高于不育株,茉莉酸甲酯与水杨酸的含量不育株高于可育株。研究结果表明植物激素类相关基因通过间接方式参与雄性不育发生过程,同时多个激素基因之间存在相互拮抗,代谢途径复杂;茉莉酸甲酯和水杨酸含量过度积累可能与雄性不育的发生相关。

盐碱胁迫对甜瓜种子萌发的影响及综合评价

本研究模拟大庆地区土壤环境配置混合盐碱溶液(Na_(2)CO_(3)∶NaHCO_(3)∶NaCl∶Na_(2)SO_(4)=3∶57∶25∶15),以100 mmol/L、200 mmol/L、250 mmol/L和260 mmol/L等4个浓度对42个甜瓜品种进行处理,研究盐碱胁迫对甜瓜种子发芽率、发芽受损率、发芽势、发芽指数等指标的影响,并对供试甜瓜品种进行耐盐碱综合评价分析。结果表明,供试品种在250 mmol/L的混合盐碱胁迫下出现萌发转折,函数分析显示,甜如蜜、懒瓜王、嘎嘎甜为耐盐碱品种;甜脆花皮(烧瓜)、Top mark、MS-5为盐碱敏感型品种。

甜瓜种子相关性状遗传规律与QTL分析

以遗传性状差异较大的厚皮甜瓜ms-5与薄皮甜瓜HM1-1为亲本配制杂交组合,利用F2∶3群体对种子相关性状进行主基因+多基因遗传模型分析,确定遗传规律,并构建遗传图谱对种子相关性状进行QTL分析。基因定位结果显示:甜瓜种皮颜色为1对基因控制的质量性状,白色对黄色显性;甜瓜百粒重和种子宽度符合A-1遗传模型,即1对主基因控制的加性-显性效应的数量性状;甜瓜种子长度符合B-1模型,即2对基因控制的加性-显性多基因数量性状。利用F2群体构建1个含有153个酶切扩增多态性序列(CAPS)标记的遗传连锁图谱,该连锁图谱覆盖总长度为1 104.2 c M,标记间平均遗传距离为7.2 c M。对甜瓜种皮颜色开展初步定位,将控制甜瓜种皮颜色的白色基因(WT)定位在第5连锁群上,两端连锁标记为HD0520和HD0519,与连锁标记的遗传距离分别为13.3 c M和7.0 c M。甜瓜种子百粒重QTL位点位于第6和第11连锁群,sw6.1位于标记E0615和E0618之间,sw11.1位于标记E1113和P1117之间。甜瓜种子长度QTL分布在第7和11连锁群,sl7.1位于标记E0716和HD0713之间,sl11.1和sl11.2分别位于标记E1110、E1112及标记XB1114、E1113之间。甜瓜种子宽度QTL位点位于第2连锁群,位于标记XB0207和E0219之间。研究结果可为甜瓜种子性状的基因精细定位与克隆提供理论依据。

分子标记辅助选择不同甜瓜性别植株

运用A和G基因鉴定甜瓜的性别类型,为甜瓜其他性状的分子标记辅助育种提供方法。根据已发表的甜瓜CmACS-7(A基因)与WIP1+Gyno-hAT(G基因)基因结构设计PCR引物,对47个重组自交系群体家系及14份甜瓜材料进行检测验证。引物CmACS-7扩增产物在383 bp进行酶切,基因型为AA不能被酶切,扩增产物均被酶切的为基因型aa,酶切位点可分辨共显性基因型;针对WIP1+Gyno-hAT基因结构设计2对引物同时扩增,扩增条带197 bp和184 bp区别G(g)基因基因型。利用自主设计的引物可用于甜瓜苗期筛选雌雄异花同株、全雌系、雄全同株和完全花植株的分子标记辅助选择育种。

甜瓜雄性不育植株雄蕊发育结构及生理生化特征

为了探索甜瓜细胞核雄性不育系ms5花药败育发生的时期及不同时期雄花物质含量与雄性不育之间的关系,采用甜瓜雄性不育两用系不育株ms5及可育株mf5雄花为研究材料,分别开展花药发育结构的电镜观察,并且对各时期雄花生理生化特性进行物质含量的测定。电镜观察显示ms5花粉育性为0,mf5花粉活力高达98%以上;不育株与可育株花药在四分体时期出现明显差异,可育株花粉囊开裂,花粉粒溢出,而不育株花粉囊干瘪,无开裂迹象。不育株各个时期丙二醛含量均高于可育株(开花前期除外),不育株可溶性糖含量都低于同时期的可育株,不育株蛋白质含量及游离脯氨酸含量均在花药发育四分体时期出现转折变化,说明不育株花器官存在物质能量代谢降低现象,物质元素的积累与甜瓜败育相关。

甜瓜果柄离区细胞学观察及成熟脱落基因AL3的初步定位

以甜瓜果实成熟不脱蒂材料M2-10为母本,易脱蒂材料ZT091为父本,配制杂交组合,获得F_(2)、F_(3)、F_(4)及回交群体,利用6世代群体分析脱蒂性状的遗传规律,显示由两对基因控制,不脱蒂与脱蒂分离比符合两对互补基因遗传规律。对亲本果实成熟期果柄与果肉连接处离区组织石蜡切片及电镜扫描观察结果表明,亲本间离区细胞存在差异,ZT091果柄离区细胞体积增大、排列松散,细胞间隙较大。利用SLAF-BSA测序,对83-F_(3)家系单基因分离群体开展控制脱蒂性状的AL3基因初步定位研究,将其定位在第8号染色体10 686 821~11 042 074 bp区间,覆盖0.355 Mb。通过亲本重测序数据挖掘SNP位点,设计CAPs标记,利用F_(4)群体将AL3最后定位在8号染色体约64.7 kb区间内(10 774 778~10 839 486bp),包含10个候选基因。

甜瓜F_2代群体果实性状的遗传分析

以果实性状差异较大的来源于美国的厚皮甜瓜ms-5和黑龙江省薄皮甜瓜HM-1为亲本,构建P_1、P_2、F_1和F_2群体,采用植物数量性状主基因-多基因混合模型对甜瓜果实单果重、果肉厚度和果肉颜色进行遗传分析。结果表明:单果重受到2对加性-显性多基因模型控制;果肉厚度受到1对主基因控制;果肉颜色受到2对加性-显性-上位效应多基因控制。主基因在F_2代群体中遗传率分别为73.79%、73.90%、88.85%。控制这3个性状的遗传率在F_2代中表现较高,说明适合早代进行选择,受环境影响小。

调控甜瓜败育基因AMS转录因子的筛选

作物雄性不育在农业生产上有巨大的应用价值,雄性不育材料能够减少人力物力投入,降低杂交育种成本。AMS (ABORTED MICROSPORES)是调控绒毡层后期的重要转录因子,在绒毡层发育过程中,任何一阶段受阻都会引起植株的雄性不育。为探究甜瓜雄性不育分子机制,本研究通过克隆AMS基因启动子,分析其启动子顺式作用元件,以AMS启动子序列作为核心序列构建诱饵载体,转化酵母菌株。通过构建甜瓜酵母单杂交cDNA文库,共转化诱饵菌株筛选得到15个阳性克隆,其中带有锌带蛋白基序的基因在所有阳性克隆中表现强阳性信号,确定该基因为AMS上游调控基因,本研究结果为研究甜瓜雄性不育产生的机理提供新的依据。