安徽部分地区鸡场鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体感染与垂直传播调查

为了解安徽部分地区规模鸡场鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)流行感染情况,试验采集21家鸡场鸡血液样品进行血清学调查,并对3家种鸡场的种鸡群及其后代雏鸡进行MG和MS的病原检测,分析种鸡及其后代雏鸡的感染情况。结果显示,MG和MS的鸡场血清阳性率分别为95.24%和90.48%,鸡群平均血清阳性率分别为75.08%和77.01%;商品蛋鸡和种鸡的MG和MS血清阳性率高于育雏育成鸡;鸡群日龄越大,MG和MS的血清阳性率越高,其中300日龄以上鸡群的血清阳性率均为100%。病原检测发现,种鸡场存在不同程度的MG和MS感染,其中MS感染率高于MG;种鸡感染率与其后代雏鸡的垂直感染存在显著正相关,并且在垂直感染的雏鸡关节组织检测出MS病原。结果表明,MG和MS在安徽鸡场中的感染较为严重,垂直传播是雏鸡早期感染的重要途径,并且MS在雏鸡垂直感染的早期即可侵入关节组织。

安徽六安地区1例鹅圆环病毒病PCR诊断与分析

[目的]对安徽六安某朗德鹅场送检的疑似圆环病毒病的病料进行鉴定。[方法]采集病例中鹅的肝脏,提取病毒DNA,根据Genbank已登录GoCV基因序列设计引物,通过PCR检测病料中GoCV,对扩增到的序列进行测序,最后将获得的序列构建进化树进行遗传进化分析。[结果]检测到大小为580 bp的目的条带,序列比对结果发现,鉴定株与山东分离株KT387277.1的遗传距离最近。[结论]该研究结果为了解该地区GoCV的流行情况提供了参考。

猪圆环病毒3型和4型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型(PCV3)和4型(PCV4)的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,根据Gen Bank已登录的PCV3和PCV4基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,经优化各反应条件,构建标准曲线,分析其敏感性、特异性和重复性,并利用建立的荧光定量PCR方法对采自安徽省的临床样品进行检测,与普通PCR方法进行一致性评价。结果显示,PCV3的标准曲线为Y=–3.534 6 logX+41.11(R^(2)=1.00),PCV4的标准曲线为Y=–3.382 5 logX+40.67(R^(2)=1.00)。PCV3和PCV4的检测限分别为49.5和27.1 copies·μL^(-1)。对猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无特异性扩增,组内和组间变异系数均<1%。临床样品检测结果显示,PCV3阳性检出率为40.8%,PCV4阳性检出率为20.4%,混合感染率为19.0%。建立了灵敏、特异,可同时快速、准确鉴别PCV3和PCV4的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,为PCV3和PCV4的检测和监测提供技术支撑。

重组酶辅助扩增结合CRISPR/Cas13a检测禽腺病毒4型方法的建立

【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)检测方法。【方法】将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a,CRISPR-Cas13a)技术相结合,针对FAdV-4 Hexon基因保守区设计RAA引物及CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以qPCR为对照方法,评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR法的一致性。【结果】本研究所建立的方法反应过程均在37℃恒温条件下完成,反应体系可检测的最低扩增拷贝数为101 copies/μL,灵敏度高,且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。该方法检测30份临床样本与qPCR检测的阳性检出率一致。【结论】建立的RAA-Cas13a方法检测FAdV-4具有简便、灵敏、特异等特点,可用于FAdV-4的快速检测和流行病学监测。

鸡MHCⅠα和β2m链基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCherry-MHCⅠβ_2m,并通过脂质体法转染293T真核表达细胞。荧光显微镜观察可见,MHCⅠα和β_2m分子主要分布于真核细胞的内膜系统,改变了与之融合的荧光蛋白在细胞内的定位。此外,Western blotting检测可见大小约68.3和41.3ku的目的蛋白反应带,表明重组质粒能够在293T细胞中顺利表达,且表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应,具有良好的免疫学活性。

番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。

安徽番鸭细小病毒的分离和PCR检测

为研究安徽省番鸭细小病毒遗传变异状况,通过番鸭胚接种分离了安徽流行株,并进行PCR检测。将扩增基因序列AH-MDPV-1和AH-MDPV-2在NCBI数据库中进行相似性搜索比对,结果显示,两者与番鸭细小病毒基因同源性均大于99%;与鹅细小病毒基因同源性分别介于79%~90%和78%~81%之间。进一步将AH-MDPV-1与7条参比的细小病毒基因序列进行比对,可见番鸭细小病毒的该部分基因相对较为保守,而与鹅细小病毒基因相应区域具有明显差异,表明该基因特异性较强,可以作为番鸭细小病毒的鉴定依据。同时可判定该病毒分离株为番鸭细小病毒。

淮南麻黄鸡MHCⅠα链基因的克隆及序列分析

典型的主要组织相容性复合体（MHC）是抗原递呈的关键分子,具有重要的免疫功能,与多种疾病密切相关。为深入了解地方品种鸡MHCⅠ类α分子的特征,尤其是抗原结合区域的特点,通过RT-PCR技术获得了29个淮南麻黄鸡完整的α链基因,并进行了分析。结果显示,淮南麻黄鸡MHCⅠα分子高度多态,但主要集中在α1和α2区域,该区变异氨基酸位点共68个,其中高度变异22个。淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域氨基酸序列同源性介于79.3%-99.5%之间,仅少部分序列完全一致。鸡氨基酸序列同源性与鸭较高,介于57.6%-64.1%之间;其次为人和鼠。进化分析显示,淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域分属于两个类群,但未显示明显的品种差异。此外,鸡与鸭的亲缘关系较近,与其他物种则遗传距离较远。研究结果表明,淮南麻黄鸡MHC分子在进化过程中呈现高度的多态性,但受到病原体的选择压力,多态性主要位于抗原肽结合部分的α1和α2区域。

安徽两个鸡场ALV-J分离株gp85基因的克隆及序列分析

为研究J-亚群禽白血病病毒(ALV-J)在安徽省鸡群中的遗传变异趋势,对分离到的2株安徽省ALV-J毒株,克隆了其gp85基因序列,并与国内外分离毒株的相应基因序列进行了比较。结果显示,ALVJ gp85基因序列具有高度的易变性,可变氨基酸残基占全长序列的22.8%。其中高变区hr1和hr2具有较多的可变位点,而可变区vr2和vr3相对较为保守。二级结构预测显示ALV-J gp85蛋白含有大量的无规则卷曲结构,尤其是hr2区域。同源性分析表明,毒株AH1103和AH1104的gp85氨基酸序列同源性为95.8%;毒株AH1103与毒株BJ090201J,ev/J的gp85序列同源性最高,毒株AH1104的gp85序列则与国内毒株HuB09JY04的同源性最高。进化分析显示,毒株AH1103和AH1104均与国内毒株NX0101和SD07LK1及美国分离株4817的遗传距离较远。

鸡主要组织相容性复合体Ⅰβ微球蛋白(β2m)基因的克隆及序列分析

为深入了解鸡主要组织相容性复合体Ⅰ（major histocompatibility complex classⅠ,MHCⅠ）β微球蛋白（β2m）分子的特征,研究β2m的免疫作用机理,试验通过RT-PCR技术获得了15条3个地方品种鸡完整的典型的MHCⅠβ2 m基因,将该序列与GenBank数据库中登录的鸭、人、鼠、鱼、猴、马和猪7个不同物种的MHCⅠβ2m分子序列进行了比对分析。结果显示,15条鸡β2m氨基酸序列同源性在98.0%~100%之间,大部分序列完全一致。鸡β2m氨基酸序列与鸭同源性最高,为60.6%;最低的则是来源于草鱼的β2m氨基酸序列,仅为33.3%。遗传进化分析进一步证实鸡与鸭的MHCⅠβ2m亲缘关系较近,与其他物种则遗传距离较远。此外,序列分析发现鸡β2 m基因高度保守,仅个别碱基发生突变。其成熟肽序列的第24和79位为半胱氨酸,在所比对的动物中均未发生突变;同时在成熟肽的第77~83位之间存在免疫球蛋白超基因家族的特征基序＂YXCXVXH＂。研究结果表明,鸡与其他物种的MHCⅠβ2m分子具有相同的免疫功能基本单位,同时又具备独特的结构特点。

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。

鸡MHCⅠα和β2m的原核表达与多克隆抗体的制备

为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。

鸭黄病毒安徽分离株NS5基因部分片段的克隆和序列分析

为研究鸭黄病毒安徽分离株遗传变异情况,通过RT-PCR获得了鸭黄病毒(Duck flavivirus)安徽分离株NS5部分基因序列DFV-NS5-1,并将该序列与GenBank数据库中登录的9条NS5基因相应序列进行比对分析。同源性分析发现克隆获得的DFV-NS5-1与国内近年来分离的黄病毒属恩塔亚病毒群的鸭坦布苏病毒基因序列同源性较高,均为98%以上;而与国外鸭坦布苏病毒NS5的EU303233基因序列的同源性相对较低,为88.5%。此外,与虫媒黄病毒属的西尼罗病毒、圣路易脑炎病毒和罗西奥病毒NS5的AF481864、EU090146和AY632542基因序列的相似度最高为74.5%。进化分析表明,DFV-NS5-1与来自于国内毒株的JQ289550、JQ314465、JF895923、JF523187和JF232077亲缘关系较近,具有共同的进化祖先,而与虫媒黄病毒属的西尼罗病毒、圣路易脑炎病毒和罗西奥病毒的遗传距离则较远。

五华鸡J亚群白血病病毒env部分基因的克隆和序列分析

本试验通过PCR技术获得了安徽省地方品种五华鸡禽白血病病毒J亚群(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)env部分基因序列ALV-J-env1,并将该序列与GenBank数据库中登录的8条env基因相应序列进行了比对分析。结果表明,五华鸡已经感染了J亚群禽白血病,且部分鸡个体已经发病。通过分析可见,ALV-J-env1与所比较的基因序列同源性介于94.2%～96.6%之间,说明不同毒株之间的env基因有一定变异。但与ALV-J-env1同源性最高的是来自于中国ALV-J毒株的HQ425636和HM235665基因序列,且在进化树中聚集为一组,暗示它们之间亲缘关系较近,由共同的毒株进化而来。与ALV-J-env1同源性最低的是来源于马来西亚毒株的AY312965基因序列,遗传进化分析也进一步证实,两者之间亲缘关系较远。

鸡MHCⅠ分子二聚体融合基因的构建及表达

为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(major histocompatibility complex,MHCⅠ)的作用机制,提高其抗原呈递的效率,获得生物活性较好的鸡MHCⅠ分子二聚体,采用4个不同长度的连接肽G_4S、(G_4S)_2、(G_4S)_3和(G_4S)_4,通过基因重组技术将MHCⅠα和β2m链基因共价连接,随后插入带有绿色荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了4个重组质粒pEGFP-MHCⅠβ_2m-α。真核细胞表达后,荧光显微镜观察可见,各重组MHCⅠ二聚体分子均主要分布于真核细胞的内膜系统。此外,Western Blot检测均可见蛋白大小约80.0 k D左右的特异反应带,表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应。研究结果表明各连接肽的重组质粒p EGFP-MHCⅠβ_2m-α均能够在真核细胞中顺利表达,且融合蛋白具有良好的免疫学活性。

番鸭细小病毒病病原的血清学检测与PCR鉴定

为了解安徽省番鸭细小病毒病的流行情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对该省内部分番鸭群进行鹅细小病毒的血清抗体检测,同时对疑似病鸭进行了病原的PCR检测。结果发现,在被检测的44份血清样本中鹅细小病毒血清抗体阳性率高达34.1%;PCR检测结果显示,所检测的样品中,有2份为鹅细小病毒阳性,1份为番鸭细小病毒阳性,且3份被检样品均来自雏番鸭。该研究结果表明,该省番鸭群中存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染,应采取有效的预防控制措施。

番鸭细小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析

为进一步了解番鸭细小病毒(MDPV)基因的遗传变异特征,本试验采用分段PCR扩增法获得了2个MDPV安徽分离株(AH1901和AH1902)基因组NS和VP全长基因,并与GenBank数据库中的20个水禽细小病毒基因组序列进行了比对。序列分析显示,克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因,分别为1884 bp和2199 bp,VP基因核苷酸序列变异程度相对较高,而NS基因则较为保守;进化分析显示,安徽分离株AH1901和AH1902位于同一分支,二者与国内分离的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因遗传距离最近,可能来源于同一毒株,与MDPV疫苗株P1及国外分离毒株FM基因遗传距离则较远;安徽分离株AH1901和AH1902的NS基因序列同源性为99.8%,VP基因序列一致。两者的NS、VP基因序列与分离株ZJ-JH-2013的同源性最高,与重组型毒株SAAS-SHNH及安徽分离株AH1401同源性也在99.5%以上;与疫苗株P1、国外分离株FM同源性则较低,其中VP基因仅为88.9%、89.3%。本试验结果表明近年国内的MDPV分离株同源性均较高,但仍存在一定程度的基因变异,增加了诊断与防控该病的难度。

我国村镇银行发展过程中面临的问题及对策——以甘肃省为例

中国银监会于2006年出台了针对农村金融的一项新政策——"调整放宽农村地区银行业金融机构准人意见",以应对农村金融业务成本高、风险大、收益低的问题。为改善地方农村的经济、金融环境,甘肃省于2007年3月成立了全省第一家村镇银行。然而由于农村地区特殊的金融环境,甘肃省村镇银行在发展过程中面临种种挑战。本文将立足于全省范围探索村镇银行在发展中,介绍甘肃村镇银行目前运行过程中面临的问题,并试图提出解决这些问题的对策。

鸡MHCⅠ类分子克隆及其二聚体融合基因的构建与表达

为进一步研究MHCⅠ类分子作用机制,以及为制备MHCⅠ基因工程疫苗奠定基础,克隆鸡MHCⅠ基因,并构建MHCⅠβ2m-α融合基因进行原核表达。运用RT-PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m链基因,并通过编码连接肽(Gly4Ser)4的基因序列将两者头尾相连,构建了pET-32a-MHCⅠβ2m-α重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组质粒在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导表达融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法分别检测表达产物。结果表明,成功克隆了MHCⅠα和β2m链基因,长度分别为1014和300 bp;构建的融合基因MHCⅠβ2m-α长度为1194 bp,经原核表达,融合蛋白分子质量约为62.0 ku,能与相应的抗体结合,具有一定的免疫学活性。

GPV·MDPV和FAdV-4三重PCR检测方法的建立

[目的]为快速地鉴别鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和禽腺病毒血清4型(FAdV-4)3种病毒,建立一种特异强、敏感高、重复性好的三重PCR检测方法。[方法]根据Genbank登录的MDPV、GPV和FAdV-4的基因序列,设计3对特异性引物,以提取的核酸为模板,进行PCR特异性、敏感性和重复性试验。[结果]采用所建立的方法能够扩增出GPV、MDPV和FAdV-4特异性片段,且不能检出鸭黄病毒(DFV)、鸭I型肝炎病毒(DVH-Ⅰ)和禽呼肠孤病毒(ARV);GPV、MDPV和FAdV-4核酸模板的最低检测量分别为20、2、2 pg;对8份阳性临床病料进行检测,可见MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100%。[结论]建立的三重PCR检测方法能够对MDPV、GPV和FAdV-4这3种病毒进行快速、准确的诊断。