建立洁净区微生物数据库与无菌药品GMP生产过程控制的探讨

目的建立洁净区微生物数据库,为追溯洁净区微生物污染来源提供依据,为无菌药品生产过程控制提供有力指导。方法对乙型脑炎减毒活疫苗生产车间洁净区环境和操作人员进行微生物负载检测,并对该车间注射用水、纯化水系统样品进行微生物限度检测,鉴别研究相应分离菌,建立洁净区微生物数据库。同时对乙型脑炎减毒活疫苗中间产品进行无菌检查检测,并对阳性结果分离菌进行鉴别分析。然后根据建立的洁净区微生物数据库对阳性结果举例进行溯源探讨分析。结果洁净区环境和人员主要存在里拉/藤黄微球菌、人葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及科氏葡萄球菌科氏亚种等革兰阳性菌和蜡样芽胞杆菌等,水系统中则主要存在少动鞘氨醇单胞菌和铫子芽胞杆菌等。中间产品无菌阳性结果主要存在里拉/藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌以及奇异变形菌等,经调查分析,分别为操作过程中经环境偶然带入或试验动物操作不慎带入。结论建立洁净区微生物数据库是追溯产品微生物污染来源的有效方法,能够为无菌药品GMP生产过程制定有效的控制措施提供依据,并使其更有针对性。

促渗剂对贴剂中双氯芬酸二乙胺的经皮促渗作用

目的制备双氯芬酸二乙胺(DDEA)水凝用胶贴剂,研究不同促渗剂对水凝胶贴剂中DDEA体外透皮吸收的影响。方法以具有良好生物相容性的亲水性高分子材料为基质材料制备DDEA水凝胶贴剂;用离体大鼠腹部皮肤为模型,采用改良Franz扩散池装置进行经皮渗透实验。HPLC法测定不同时间点接收池中DDEA的浓度,计算药物的累积渗透量和经皮渗透动力学参数。结果不同促渗剂对DDEA的经皮渗透有不同程度的促进作用,其中薄荷脑的促渗作用最为显著。薄荷脑对DDEA的促渗在1%～5%,呈正相关剂量效应关系,薄荷脑用量为5%时,药物的稳态透皮速率可达18.121μg.cm-2.h-1,与空白对照组相比增渗倍数为5.45。结论薄荷脑可作为DDEA水凝胶贴剂的促渗剂,并可开发此新型水凝胶贴剂。

新建疫苗车间洁净度确认及环境监测微生物数据库的建立

目的对新建疫苗生产车间环境微生物检测方法及车间洁净度进行确认,建立环境监测微生物数据库。方法使用连续3批次的胰酪大豆胨琼脂(Tryptose soya agar,TSA)培养皿和TSA(L-80)接触碟对环境微生物检测方法进行确认;对新建车间连续进行3次静态和3次动态检测,包括悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物检测;对微生物检测所获得的菌株进行鉴定。结果确认了环境微生物检测方法的有效性,新建车间洁净度达到了设计要求,建立了环境监测微生物数据库,主要菌型为里拉/藤黄微球菌、沃氏葡萄球菌、人葡萄球菌、科氏葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、表皮葡萄球菌。结论新建车间洁净度符合标准,环境监测微生物数据库的建立有助于污染源的调查分析,对无菌药品生产过程污染的有效控制提供了必要的技术保障和检测手段。

Ⅱ级生物安全柜的安装、运行和性能再确认

对1台Ⅱ级生物安全柜BHC-1600ⅡA/B3(Ⅱ级生物安全柜)进行安装、运行和性能再确认,以确认Ⅱ级生物安柜的安装现场、运行工况和性能参数能否达到其使用说明书和相关法规标准。依据Ⅱ级生物安全柜的再确认方案分别对其实施安装、运行和性能再确认。结果表明,Ⅱ级生物安全柜的再确认结果都达到接受标准,各项确认结果符合规定。Ⅱ级生物安全柜的再确认结论判为合格,Ⅱ级生物安全柜的安装合规,运行正常,性能参数达标,可用于第三类病原微生物菌毒种及样本的实验活动。

不同细胞进行牛血清中牛源病毒检测的比较试验

对不同细胞进行牛血清中牛源病毒检测的比较实验,选出用于牛血清中病毒检测的最适合外源病毒增殖的细胞,从而提高血清中病毒的检出率,以确保用于疫苗生产的牛血清安全可靠。将牛腹泻病毒、牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒和狂犬病毒接种到培养好的MDBK细胞、VERO细胞、BT细胞中,逐日观察细胞的病变情况,待观察到10%细胞出现病变或者培养7 d后,进行免疫荧光染色,选出适合用于六种病毒增殖的细胞系。结果显示,BT细胞对所有病毒敏感,VERO细胞对BAV、BVDV病毒不敏感,MDBK对REO、BVDV、RV三种病毒不敏感。综合比较后,选择BT细胞为BPIV、BPV、BAV、BVDV的增殖及实验用细胞,VERO细胞为REO、RV的增殖及实验用细胞。

洁净室环境监测用培养基贮存效期的验证及方法学确认

目的验证洁净室环境监测用培养基的贮存效期,同时对环境监测浮游菌、沉降菌及表面微生物检测方法进行确认。方法对连续3批次贮存0、90、120 d洁净室环境监测用胰酪大豆胨琼脂(Tryptose soya agar,TSA)培养皿和TSA(L-80)接触皿进行相应菌液适用性检查(包括促生长能力和无菌检查)验证试验;并对贮存120 d TSA培养皿和TSA(L-80)接触皿分别进行环境浮游菌和沉降菌、表面微生物最长采样时间检测,然后再进行促生长能力测试。结果 TSA培养皿和TSA(L-80)接触皿贮存120 d (2～8℃90 d,25℃30 d)的适用性检查结果均符合《中国药典》2015版(三部)对培养基质量控制的要求。贮存120 d TSA培养皿进行洁净室环境浮游菌(主动采样10 min)、沉降菌(暴露采样4 h),以及TSA(L-80)接触皿进行表面微生物(接触采样10 s)检测后均具有良好的促生长能力。结论通过验证试验,确定了环境监测用TSA培养皿和TSA(L-80)接触皿的贮存效期120 d(2～8℃90 d,25℃30 d),并确认了贮存后TSA培养皿进行洁净室环境浮游菌、沉降菌检测的有效性,以及TSA(L-80)接触皿进行表面微生物检测的有效性。

VHP灭菌技术在无菌检查试验中的应用

为研究汽化过氧化氢灭菌技术(VHP)在无菌检查过程中的应用,将供试品等物品放入VHP传递仓灭菌,使用既定灭菌参数,通过BI挑战性试验、灵敏度试验等验证灭菌后的参数是否符合质量标准的要求。结果表明,使用既定参数设定,可以将VHP灭菌技术运用于疫苗无菌检查物品表面灭菌中,方法可靠有效。

疫苗生产洁净室消毒剂的验证

目的根据消毒剂的实际使用方式，验证疫苗生产洁净室4种消毒剂的使用效果，为无菌生产控制提供依据和保障。方法对于洁净室的日常表面消毒，采用2%84消毒液、0.1％新洁尔灭消毒液、1％Minncare杀孢子剂和75％乙醇进行实验室悬液定量杀菌试验、环境获得菌不锈钢载体杀菌试验以及材料耐受性确认。另外，用75％乙醇进行人员手部冲淋消毒现场确认，用84消毒液、新洁尔灭消毒液和杀孢子剂各连续3次消毒后进行洁净室静态环境微生物检测。结果在悬液定量杀菌试验中，新洁尔灭消毒液和乙醇对枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液作用10和20min、84消毒液作用10min，杀灭对数值均〈5．00，未达到标准；其余实验室试验结果均符合规定。在乙醇手部冲淋消毒现场确认中，所有人员五手指印微生物检测均为阴性。洁净室经连续3次84消毒液、新洁尔灭消毒液和Minncare杀孢子剂表面消毒后，静态环境微生物检测均为阴性。结论经过验证，以上4种消毒剂在预定使用条件下均有效，能够较好地控制洁净室的洁净度。

乙型脑炎减毒活疫苗及稀释剂与其直接接触的包装容器的相容性

目的考察乙型脑炎减毒活疫苗及稀释剂与其直接接触的包装容器的相容性,评估疫苗及稀释剂现用包装容器的适宜性。方法分别检测已包装的疫苗、稀释剂在加速条件及规定储存条件下,其包装容器的外观、胶塞对疫苗的吸附度,胶塞中抗氧剂2,6-二叔丁基对甲酚(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)和玻璃瓶中有毒有害金属离子As、Sb、Pb、Cd迁移量,玻璃瓶内表面脱片风险等,分析乙型脑炎减毒活疫苗及稀释剂现用包装容器对产品质量的影响程度及包装容器是否被疫苗或稀释剂腐蚀受损。结果 3批乙型脑炎减毒活疫苗在(25±2)℃、相对湿度(RH)(60±5)%放置6个月,(37±2)℃、RH(75±5)%放置4周,2~8℃放置24个月,疫苗及包装材料(容器)外观与0月结果一致,胶塞对疫苗的吸附度低于0.05%,包装容器中抗氧剂BHT及有毒有害金属离子As、Sb、Pb、Cd迁移至疫苗中的量远低于安全限值,玻璃瓶内表面被疫苗腐蚀脱片的风险较低。3批稀释剂在(40±2)℃、RH(75±5)%放置12个月,2~30℃放置至42个月,稀释剂及包装材料(容器)外观与0月结果一致,包装容器中抗氧剂BHT及有毒有害金属离子As、Sb、Pb、Cd迁移至稀释剂中的量远低于安全限值,玻璃瓶内表面被稀释剂腐蚀脱片的风险较低。结论乙型脑炎减毒活疫苗及稀释剂分别与其包装容器发生相互作用的风险可接受,显示了良好的相容性,表明现用包装容器是适宜的。

疫苗生产车间环境监测微生物的数据库建立及分析

目的建立疫苗生产车间环境监测微生物数据库，分析生产车间微生物的分布情况。方法从2012至2016年，每年按一定频次对乙型脑炎减毒活疫苗生产洁净车间进行动态环境监测。对收集的微生物进行鉴别和分类，建立微生物数据库。对5年的数据进行统计和分析。结果2012—2016年，A级洁净区微生物阳性率均为0．00％；B级洁净区微生物阳性率分别为2．89％、1．32％、1．27％、1．03％和1．04％；C级洁净区微生物阳性率分别为12．96％、10．14％、7．63％、4．43％和4．56％；D级洁净区微生物阳性率分别为31．20％、33．41％、28．04％、19．58％、22．02％。洁净区表面菌阳性率（1．21％～2．62％）低于沉降菌阳性率（2．29％-4．02％）和浮游菌阳性率（2．09％～3．67％）；沉降菌阳性率和浮游菌阳性率相似。里拉／藤黄微球菌、葡萄球菌属、蜡样芽胞杆菌容易出现在洁净车间环境中。结论建立的环境监测微生物数据库和对微生物的分布情况分析，对于疫苗生产过程的无菌控制具有指导意义。

疫苗生产洁净车间悬浮粒子的动态监测和趋势分析

目的 对疫苗生产车间半成品配制区域的悬浮粒子进行动态监测和数据分析.方法 采用便携式悬浮粒子采样仪,于2016和2017年对乙型脑炎减毒活疫苗生产洁净车间进行日常悬浮粒子检测,其中A、B级洁净区域为每班次检测,C级洁净区域为每周检测.对2年的检测数据制作单值-移动极差控制图,并进行t检验比较.结果 3个级别洁净区域的悬浮粒子数或均值如下,A级区≥0.5 μm的粒子数均<1,≥5.0μm的粒子数均为0.B级区≥0.5 μm的粒子数均值:2016年为46.82(0~143.21),2017年为38.83(0~125.33);≥5.0μm的粒子数均值:2016年为2.52(0~7.83),2017年为2.41(0~7.15).C级区≥0.5 μm的粒子数均值:2016年为214.64(0~679.16),2017年为209.81(0~619.31);≥5.0 μm的粒子数均值:2016年为15.04(0~47.13),2017年为14.16(0~39.24).3个洁净区域的悬浮粒子数均小于95%置信上限且均符合GMP范围要求.2016和2017年检测数据的差异无统计学意义(t值为0.14~1.02,P值均>0.05).结论 疫苗生产车间半成品配制区的悬浮粒子动态监测结果符合GMP标准.

疫苗分装区环境监测与质量控制分析

目的建立洁净区环境监测微生物数据库,统计分析悬浮粒子动态监测变化情况,确认疫苗分装区的洁净度符合疫苗生产要求。方法对疫苗分装区进行空气调节系统性能再验证环境监测,对该区域的培养基灌装试验进行在线环境监测,对以上所有环境监测获得菌进行菌型分析,建立环境监测微生物数据库。结果在分装前准备、分装中产品入柜和排除故障、分装后清场期间,悬浮粒子浓度变化明显,出现峰值(≥0.5 μm悬浮粒子浓度最大值1 624粒/m3),但整体水平仍较低。监测到的微生物主要菌型包括里拉/藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、人葡萄球菌、科氏葡萄球菌科氏亚种、沃氏葡萄球菌等。结论疫苗分装区洁净度符合无菌药品生产要求,环境监测微生物数据库的建立和悬浮粒子监测结果的统计分析,为制定有效的无菌药品生产质量控制措施提供了必要且针对性较强的依据。