EV71与CB3病毒VP1融合蛋白的构建表达与抗原性初步评价

目的构建pET-22b-ECVP1表达载体,在大肠杆菌中诱导表达肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇B3型(CB3)病毒VP1融合蛋白(ECVP1),并鉴定其抗原性。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分别从EV71与CB3病毒基因组中扩增得到外壳蛋白VP1基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法拼接构建重组融合蛋白基因(ecvp1),将该片段连接到pET-22b表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白,经Western blot鉴定其抗原性。结果pET-22b-ECVP1表达载体构建成功,融合蛋白相对分子量约为65 ku,Western blot分析表明,该融合蛋白能被抗EV71及抗CB3抗体特异识别。结论成功构建pET-22b-ECVP1表达质粒并诱导ECVP1融合蛋白表达,且融合蛋白具有良好的抗原性。

人β防御素1～4抑菌及盐敏感性研究

目的对人β防御素(hBD)1～4的抑菌及盐敏感性进行测定并分析其二级结构对抑菌及盐敏感性的影响。方法圆二色谱预测hBD 1～4的二级结构,应用抑菌实验来测定抑菌效力,提高溶液中的NaCl浓度来进行盐敏感性分析。结果获得了4种hBD的圆二色谱谱图并进行分析。实验发现hBD-1抑菌活力低,抑菌谱窄,hBD-2、hBD-4抑菌活力好于hBD-1,抑菌谱也更广,但是对盐耐受力差,而hBD-3在这4种防御素中拥有最强的抑菌活性及耐盐效力。结论 4种hBD具有不同的抑菌活性和盐敏感性。防御素的理化性质与二级结构共同决定了抑菌活力及其盐敏感性。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA和EspB蛋白的重组表达及其免疫效果

目的:通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7的EspA和EspB蛋白,并分析它们的免疫保护性。方法:采用PCR技术从EHEC O157∶H7基因组中扩增espA和espB基因,连接至pET-22b(+)载体上,转化至宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,免疫小鼠分析其免疫保护性。结果:重组espA和espB基因片段的测序结果与GenBank中的相应基因序列完全一致,一致性均为100%;得到了纯度为95%以上的重组EspA和EspB蛋白,免疫小鼠所得到的抗体效价均为106。结论:重组EspA和EspB蛋白获得了可溶性表达,表达的蛋白具有良好的免疫保护性,为进一步制备疫苗奠定了基础。

肠出血性大肠杆菌毒力相关基因突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、espB、espD,构建3株突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增基因两翼的同源序列;将PCR产物插入pEASY-T1载体并测序,将测序正确的上、下游同源序列分步酶切,构建于pUC19-kan质粒上,经PCR获得两端同源序列中间嵌合卡那霉素抗性基因标记的线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术,敲除espA、espB、espD基因,之后转入pCP20质粒以去除抗性标记,最后测定突变株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、es pB、espD,获得3株突变株,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:为进一步研究espA、espB、espD基因在肠出血性大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用奠定了基础。

KPC-2型碳青霉烯酶的表达纯化及其催化抗生素水解的动力学

目的:表达纯化KPC-2型碳青霉烯酶,并研究其催化抗生素水解的酶动力学活性。方法:将KPC-2基因与pET-22b(+)原核表达载体连接后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经FF镍柱纯化后,SDS-PAGE检测蛋白的纯度;用BioTek酶联仪进一步检测其抗生素水解范围及动力学特性。结果:构建了高效表达KPC-2的工程菌,得到了纯度在90%以上的KPC-2蛋白,该蛋白能水解几乎所有β内酰胺类抗生素,其水解美罗培南等碳青霉烯类抗生素的能力较强,最适温度约为40℃,最适pH值约为6.5。结论:为进一步了解最常见的KPC功能与活性提供了重要信息。

新课程标准下的美术课应“美味”

在推进素质教育的过程中，越来越多的人认识到美术教育在提高与完善人的素质方面，所具有的独特审美的作用。新课程目标下的美术教育应抓住发展机遇，在全新的教育理念下，从内容和形式上力求“美味”，以给人带来美的感受，实现真正的以学生为本的探究性学习和多元化评价。

不同激光参数对LCD线不良修复效果的影响研究

本文以65 UHD TFT-LCD作为研究对象,针对成盒后的源极线断路不良,探究不同激光参数对维修后显示效果的影响。通过对比维修后不同显示效果下的源极线电阻,得出线路电阻值的大小影响LCD的显示效果,阻值改变越小,显示效果越好;当维修后阻值超过正常值大约6%时,视觉上可见薄暗线类不良。维修中影响阻值的因素主要为激光波长、激光强度、光斑大小,将上述3个因素作为变量,测量维修后的源极线电阻,探究维修的最佳参数。实际维修中选择532nm波长焊接,光斑大小设定为1/2源极线宽,最终维修成功率提升了20%。

EHEC的新型粘附因子研究进展

肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage E.coli,EHEC)是一种重要的人畜共患病,世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC有多种血清型,其中毒力最强血清型是O157:H7。EHEC O157:H7感染除可使人发生常规腹泻外,还可在5%-10%的病例中引发严重并发症,甚至死亡。该菌是重要的食源性致病菌,危害严重,缺乏有效的防治手段,而抗生素治疗可能会加剧溶血性尿毒症(haemolutic uraemic syndrome,HUS)。由于以上特点EHEC O157:H7成为世界公共卫生问题,引起微生物学家和公共卫生工作者的广泛关注。目前,临床针对EHEC感染只是对症治疗和适当的抗菌治疗。粘附是EHEC感染宿主细胞的第一步,没有这一步,细菌和宿主肠道细胞之间不会发生任何的相互作用,而且对于许多病原菌来说,粘附具有宿主特异性。本文概述了EHEC的流行病学及粘附机理,并对近年在EHEC研究中的发现一些新型粘附因子和一些假设的定植因子的研究背景及作用机理作一综述。

突触小泡膜蛋白VAMP-2的原核表达、纯化及活性鉴定

目的克隆突触小泡膜蛋白(VAMP-2)基因,原核表达、纯化并鉴定重组蛋白VAMP-2活性。方法根据GenBank中已报道的VAMP-2基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR从小鼠的全脑组织总RNA中获得基因。将去疏水区后的基因克隆至含有N端信号肽pelB序列的原核表达载体pET-22b中,重组质粒转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE及Western印迹进行鉴定,并利用金属内肽酶BoNT/B轻链对该蛋白进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论成功构建pET-22b-VAMP-2表达质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta,Western印迹证实重组蛋白VAMP-2(残基Met 1-Met 94)获得可溶性表达。重组蛋白VAMP-2可被金属内肽酶BoNT/B特异性酶解,具有良好的生物学活性。