Bcl-2短发夹状RNA增强甲氨喋呤对人淋巴瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的:观察Bcl-2短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)与甲氨喋呤(methotrexate,MTX)联用后对人淋巴瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:45只裸鼠注射Raji细胞悬液制备裸鼠人淋巴瘤模型,将聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)与Bcl-2shRNA载体质粒(本实验室制备)的混合物及MTX直接注入肿瘤内,观察Bcl-2shRNA及联合MTX对肿瘤生长的影响。在用药21d后无痛处死动物,分离皮下肿瘤,称重,计算抑瘤率;H-E染色观察肿瘤组织的病理形态;以RT-PCR法检测Bcl-2mRNA在肿瘤内的表达情况。结果:Bcl-2shRNA与MTX联用组移植瘤的生长最慢,与单用Bcl-2shRNA和MTX相比差异有统计学意义(P<0.05)。处理结束后剥离瘤块,Bcl-2shRNA组瘤质量与阴性shRNA组、空质粒组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2shRNA与MTX联用对裸鼠移植瘤生长的抑制率最高,高于Bcl-2shR-NA和MTX的单用组(P<0.05)。H-E染色可见使用Bcl-2shRNA组及MTX组出现明显的凋亡和组织坏死。瘤组织的单细胞悬液经RT-PCR检测显示Bcl-2mRNA表达在Bcl-2shRNA组均显著下降(P<0.05),而对照组则无明显变化。结论:Bcl-2shRNA可增强MTX对人淋巴瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用。

siRNA及其导入体内外方法的研究进展

RNAi是一种有效的基因封闭工具,siRNA诱导RNAi效应的发挥。siRNA将哺乳动物细胞内特异基因的mRNA特异性降解而使基因失活,引起转录后基因沉默。siRNA有效作用的发挥关键是依赖它本身的性能及能否较高效率地转染入靶细胞后与靶基因结合。在体外常通过脂质体、聚乙烯亚胺及电穿孔等介导siRNA的转染。siRNA导入体内的过程则要复杂的多,到目前为止仍缺少有效的方法,常用脂质体和聚合物等来介导转染,依赖靶组织和靶细胞的类型来选用转导途径。

Bcl-2 shRNA诱导成人T淋巴细胞白血病细胞株Molt4凋亡的研究

目的:探讨以Pgenesil-1质粒为载体表达的Bcl-2短发夹样RNA(short hairpin,shRNA)诱导Molt4成人T淋巴细胞白血病细胞株凋亡的作用。方法:采用脂质体介导的转染方法将表达Bcl-2 shRNA的两个RNA干扰质粒(Bcl-2 shRNA1和Bcl-2 shRNA2)、阴性组(针对非目的基因所构建的shRNA表达载体)、空白组及单纯脂质体组分别转染Molt4细胞。采用免疫细胞化学法检测转染48 h后的各组细胞Bcl-2蛋白表达水平;MTT法分别检测24,48,72 h各组细胞的增殖活性;用姬姆萨染色和流式细胞仪观察细胞凋亡情况。结果:转染Molt4细胞48 h后,Bcl-2 shRNA1组和Bcl-2 shRNA2组的细胞Bcl-2蛋白表达率均明显下降;与阴性对照shRNA组、空白组和单纯脂质体组相比差异有显著性(P<0.05),Bcl-2 shRNA1组的抑制作用要强于Bcl-2 shRNA2组。MTT测定显示Bcl-2shRNA1组和Bcl-2 shRNA2组细胞增殖活力均明显下降,分别与空白组和单纯脂质体组进行比较差异有显著性(P<0.05);阴性对照shRNA组与单纯脂质体组比较则无明显差异(P>0.05)。Bcl-2 shRNA1和Bcl-2 shRNA2作用于Molt4细胞48 h后,姬姆萨染色可见凋亡细胞。流式细胞仪检测示Bcl-2 shRNA1组和Bcl-2 shRNA2组细胞凋亡率随时间逐渐增高,与空白组和单纯脂质体组进行比较差异有显著性(P<0.05),但Bcl-2 shRNA1组和Bcl-2 shR-NA2组二者间无明显差异(P>0.05)。结论:Bcl-2 shRNA表达载体可促进Molt4细胞的凋亡。

Bcl-2 shRNA对甲氨蝶呤诱导的Raji细胞凋亡及细胞增殖作用的影响

目的:探讨Bcl-2短发夹样RNA(short hairpin,shRNA)对甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)诱导的人Burkit淋巴瘤Raji细胞凋亡的增强作用。方法:采用脂质体介导的转染方法将构建有Bcl-2 shRNA的质粒转染Raji细胞,然后加入MTX,采用RT-PCR法检测作用48h时细胞Bcl-2mRNA表达水平,免疫荧光法检测细胞中Bcl-2蛋白表达水平,MTT法检测经处理24、48和72h后细胞的增殖活性,Giemsa染色及FCM法检测细胞凋亡。结果:将Bcl-2 shRNA质粒转入Raji细胞后,Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05),转染Bcl-2 shRNA联用MTX可明显诱导细胞凋亡,细胞增殖活性显著降低,分别与MTX组、阴性shRNA联用MTX组、Bcl-2 shRNA组及空质粒+MTX组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Bcl-2 shRNA可增强MTX对Raji细胞增殖的抑制作用,增加对细胞凋亡的诱导作用。

大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能样细胞的体外分化

目的探索大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能样细胞分化。方法全骨髓培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞;体外培养至第3代,用碱性成纤维细胞生长因子,抗坏血酸和表皮生长因子诱导分化;免疫荧光法鉴定胞质中的多巴胺神经元相关蛋白的表达;RT-PCR鉴定多巴胺神经元相关基因的表达;ELISA法检测上清及胞质中的多巴胺。结果诱导后,免疫荧光法检测到诱导后的细胞表达多巴胺神经元相关蛋白:酪氨酸羟化酶、多巴胺转运蛋白和神经核蛋白;RT-PCR检测到诱导后的细胞表达多巴胺神经细胞相关基因TH、AADC;ELISA法检测到诱导后的上清及胞质中有多巴胺分泌。结论间充质干细胞具有向多巴胺能样细胞分化的能力。

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶

目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)表达酪氨酸羟化酶,为帕金森病细胞移植替代治疗提供特异性分化的细胞。方法:在无菌条件下从SD大鼠的股骨中分离骨髓间充质干细胞,体外培养传3代后,用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和抗坏血酸诱导MSCs表达酪氨酸羟化酶。在镜下,观察MSCs在诱导前后的形态变化;用免疫荧光染色检测酪氨酸羟化酶的表达。结果:MSCs经诱导分化后,胞体逐渐变圆,并伸出神经轴突、树突样突起;免疫荧光化学表明细胞酪氨酸羟化酶染色呈强阳性反应。结论:SD大鼠骨髓间充质干细胞在体外能被定向诱导表达酪氨酸羟化酶,有可能为帕金森病治疗提供特异性分化的细胞。