强化嗜盐四联球菌对模拟低盐酱油发酵的影响

通过模拟低盐酱油快速发酵,在添加鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的基础上,考察嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)不同添加量对酱醪理化指标、氨基酸和有机酸含量、挥发性风味物质的影响,揭示嗜盐四联球菌在提高低盐酱油品质方面的应用潜力。结果表明,嗜盐四联球菌对酱油中酵母菌的生长有一定的抑制作用,会使酱醪pH略有下降,总酸和氨基酸态氮含量提高。最适宜提高酱油品质的菌株添加方式是发酵开始接入鲁氏接合酵母,发酵10 d后添加108 CFU/g嗜盐四联球菌,酱油样品中氨基酸和有机酸总量比单独添加酵母菌分别提高43.8%、55.6%,其中鲜味和甜味氨基酸分别提高33.7%、29.9%;挥发性风味物质种类增加43.2%,总量提高2.4倍,其中香气物质愈创木酚和1-辛烯-3-醇含量分别提高11.1倍、8.9倍。

L-氨基酰化酶产生菌的筛选及其固态发酵工艺

从13株米曲霉菌株中筛选到一株产氨基酰化酶活力较高的米曲霉(Aspergillus oryzae)WO607,以米曲霉WO607为生产菌固态发酵生产氨基酰化酶,较适的培养基组成和培养条件为:麸皮7.0 g,豆饼粉3.0 g,蛋白胨0.3 g,水11 mL,pH值6.5,发酵温度28℃,发酵周期约48 h.在此条件下,米曲霉WO607的氨基酰化酶产率为400 U/g左右.

高产α-酮戊二酸解脂亚洛酵母的选育及其发酵过程优化

为了提高解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)发酵生产α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)的效率,对前期获得的1株α-酮戊二酸高产菌株1-C6进行了迭代诱变处理,并对最终获得的高产突变菌株进行了系统的发酵过程优化。首先,基于前期构建的高通量筛选方法,应用甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)、亚硝基胍(nitroso-guanidin,NTG)和紫外(ultraviolet,UV)等诱变方法对菌株1-C6进行迭代诱变,最终获得了1株高产突变菌株4-E2,其α-KG的产量相对出发菌株1-C6提高了56.7%。在3 L发酵罐水平上研究了搅拌转速、通风比、乙酸钠和CaCO 3添加量等条件对高产突变菌株4-E2积累α-KG的影响。结果表明,较高转速的两阶段通风比更适合于α-KG的生产,乙酸钠和CaCO 3的最佳添加量分别为6 g/L和10 g/L。在此基础上进行补料发酵策略的探索,确定了恒速连续补料发酵的策略,α-KG产量达75.86 g/L,相比分批发酵提高了44.4%。研究结果为促进发酵法生产α-KG的工业化提供了借鉴意义。

生物工程综合实验教学创新体系的构建

根据生物工程综合实验教学的实践和体会,以在实验教学中培养学生的创新能力为目标,对生物工程综合实验的教学内容、教学方法和手段、实验考核方法进行了改革,构建了生物工程综合实验教学创新体系。

真菌α-淀粉酶产生菌的筛选及其固态发酵条件的初步研究

从酒曲和酒药中分离筛选出一株产α-淀粉酶的菌株A019。经形态学初步鉴定为米曲霉。研究了碳源、氮源、培养温度与时间等因素对A019产酶的影响,并用响应面法对培养基组成进行了优化。最佳的培养基组成和培养条件为:麸皮8g,豆饼粉2.28g,酵母膏0.1g,K2HPO4·3H2O1%,MgSO4·7H2O0.094%,加水量12.9ml,培养基的起始pH5.0左右,28℃培养48h。在此条件下α-淀粉酶的酶活达到410U/g干曲左右。

半纤维素酶高产菌种的选育及产酶条件

以黑曲霉WA301为出发株,经过紫外诱变获得一株遗传性状稳定的半纤维素酶的高产突变株WA9024.通过对培养基中碳源、氮源、水分和起始pH值的优化,突变株WA9204以麸皮为基质的固态发酵产半纤维素酶的能力进一步得到提高.在较适的条件下,WA9024的甘露聚糖酶酶活达到8984U/g,木聚糖酶酶活达到503U/g,分别比出发菌株提高了1160%和210%.

碱性脂肪酶高产菌的平板筛选模型

通过研究三丁酸甘油酯和丁酸对圆弧青霉白色变株PI4 2生长及产脂肪酶的影响 ,建立了碱性脂肪酶高产菌的平板筛选模型。以该模型对PI4 2进行自然分离 ,从中得到一株遗传性状稳定的高产菌 ,脂肪酶产率提高了 85%。该菌株在 2 5L罐中采用流加发酵工艺培养 72h ,发酵产酶水平达到 550 0U/mL。

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的摇瓶发酵条件

在摇瓶条件下,对黑曲霉WA301生产酸性β-甘露聚糖酶的发酵条件进行了探索,研究结果表明。该菌株较适的产酶培养基组成为:魔芋粉3.0％,麸皮3.0％,玉米浆6.0％、KH2PO40.5％、MgSO40.3％,初始pH5.5。于35℃.250r/min振荡培养96h,β-甘露聚糖酶活力最高达109U/ml。

通过解除磷酸糖胁迫提高枯草芽孢杆菌N-乙酰氨基葡萄糖合成能力

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)在食品、保健品以及药品领域有着广泛的应用。该课题组前期构建了一株具有较高GlcNAc合成效率的枯草芽孢杆菌底盘细胞FMIK,由于GlcNAc前体的过量积累引起了磷酸糖胁迫,限制了FMIK的GlcNAc产量。因此,该文首先通过实施荧光定量PCR验证磷酸糖胁迫对于glcR-ywpJ操纵子转录水平影响,并通过凝胶迁移率确定GlcR与P_(glcR)的结合能力;然后,利用易错PCR构建P_(glcR-ep)突变体库,设计并使用基于荧光检测的高通量筛选系统,鉴定得到P_(glcR)与GlcR结合的关键区域;最后,在FMIK菌株的基础上对筛选得到的P_(glcR)与GlcR的结合关键区域进行敲除,得到工程菌株FMIK-m4。该菌株有效降低了GlcNAc前体浓度,解除了磷酸糖胁迫导致的二次生长现象,且摇瓶内GlcNAc产量提高至18.21 g/L。

黑曲霉固态发酵生产酸性β-甘露聚糖酶

以黑曲霉WA30 1为生产菌固态发酵生产酸性 β -甘露聚糖酶 ,较适的培养基组成和培养条件为 :麸皮 10g,魔芋粉 0 4g,豆饼粉 1 5g,硫酸铵 0 2g ,起始湿度 5 5 % ,pH自然 ,发酵温度 35℃ ,发酵周期约 96h。在此条件下 ,WA30 1的酸性β-甘露聚糖酶产率为 95 0U/g干曲左右。

转氨酶产生菌的筛选鉴定及其摇瓶发酵条件的优化

从土壤中分离到1株具有支链氨基酸转氨酶活性,且亮氨酸转氨酶活性较高的菌株WJ44。通过观察形态特征、生理生化实验以及16SrRNA序列的比对和系统发育分析,鉴定其为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。经过对产酶条件的优化,确定最佳摇瓶产酶条件为:葡萄糖20g/L,蛋白胨15g/L,牛肉膏5g/L,玉米浆15g/L,KH2PO43g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,初始pH7.0,培养温度37℃,装液量20mL/250mL三角瓶,摇床转速200r/min。WJ44菌株在最佳产酶条件下培养10h其亮氨酸转氨酶酶活即可达到45.787U/mL,菌体干重8.643g/L,分别比原来提高了54%与10%,是一株产酶和生长性能较佳的菌株。

生物转化法合成葡萄糖基抗坏血酸的产酶菌株筛选及发酵条件优化

从土壤中筛选到1株产α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20,α-glucosidase)的菌株WPD2,通过对其进行形态学和18S rDNA序列分析及系统发育研究,该菌株初步鉴定为黑曲霉(Aspergillus nigerEU366904),该菌经产酶、转化反应后葡萄糖基抗坏血酸产量达到370 mg/L左右。摇瓶实验确定了优化后的产酶条件为:培养温度34℃,培养时间60 h,以110 g/L的麦芽糖为碳源、10 g/L的(NH4)2SO4为氮源,优化后葡萄糖基抗坏血酸产量达到410 mg/L左右。

发酵法生产L-异亮氨酸的溶氧控制策略

研究了溶氧对Brevibacterium lactofermentation分批发酵生产L-异亮氨酸(Ile)的影响,提出了前10h恒700r/min以维持溶氧在35%以上,10h后调至600r/min以维持溶氧在15%～20%的两阶段供氧控制模式。与对照相比,获得了较高的产率(0.094g/g)和糖耗速度(4.76g/L·h),在较短时间内(52h)获得较高的Ile产量(23.3g/L),比结果最好的单一搅拌转速(600r/min)提高11.6%。生产强度(0.448g/L·h)比恒定搅拌转速(500、600、700、800r/min)控制下的过程分别提高了83.6%、28.7%、44.9%、35.7%。最后采用代谢通量分析对该结果产生的原因进行了定量解释。

1株产丝氨酸羟甲基转移酶菌株的分离鉴定及其培养条件优化

从甲醇污染土壤中分离得到1株能在含2%甲醇的培养基上生长且产丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的菌株,ML206,酶活达到0.030 U/mL。将ML206菌株的16S rDNA序列(No.EF612770)和GenBank数据库中已报道的16S rDNA序列进行Blast比对和系统发育分析,结合形态学和生理生化鉴定结果,确定ML206为嗜胺甲基杆菌(M.aniovorans)。经过对产酶条件的优化确定最佳氮源、碳源及培养件为:(NH_4)_2 HPO_4 0.8%,CH_3OH 2%,pH 7.0,温度30℃;采用分批的方式添加甲醇,培养时间由72 h缩短至48 h,节省了33%的培养时间。在优化的培养条件基础上进行实验,菌体浓度比原来提高了50%,SHMT活力提高了20%。经过对该菌的各种特性的研究确定了其为1株良好的产SHMT的新型出发菌。

谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化

用大肠杆菌AS1.505进行液态发酵生产谷氨酸脱羧酶并优化培养基,考察了碳源、氮源、复合营养物质、起始pH及发酵时间对酶活的影响,确定最佳产酶培养基组成为:葡萄糖1.0 g/dL,蛋白胨3.0 g/dL,氯化钠0.3 g/dL,磷酸氢二钾0.1 g/dL,硫酸镁0.02 g/dL,L-谷氨酸0.01g/dL,玉米浆1.5 g/dL,生物素30μg/L,麸皮4 g/dL;pH 6.5。在此基础上,设计发酵条件的优化实验。实验结果表明为:250 mL的三角瓶装液量25 mL,37℃,起始pH 6.5,培养18 h达到产酶高峰,产酶活力可达1 290 U/mL。

庆大霉素发酵液薄层色谱(TLC)分析方法研究

通过对庆大霉素(GM)薄层色谱(TLC)检测体系进行优化,得出了最佳的制板条件,最佳展开剂系统以及显色系统,并对该检测方法的重复性以及检测限进行了考察。最终将得到的最佳检测体系应用到庆大霉素发酵液的检测中,成功实现了对发酵液主组分C1,C1a,C2(C2a+C2)的有效分离检测,分离度及Rf值均达到要求。并且,通过对发酵液进行简单的纯化浓缩后,运用该检测体系成功实现对10个组分的有效检测。另外,将该TLC体系与微生物效价检定法结合,可以较准确地得到各组分的含量比,通过与HPLC检测结果进行比较,发现结果基本一致。该方法简单快速,结果可靠,能满足发酵试验与生产中对成份需要快速检测的要求。

酱油变质微生物因素及乳酸菌在防腐中的应用

酱油是经微生物发酵制成的具有独特色、香、味的液体调味品。酱油中含有充足的营养物质,并且酱油发酵体系多为混菌体系,因此在酱油发酵、生产和贮藏过程中容易因污染腐败菌出现“生花”、变馊、胀袋、沉淀、浑浊等现象,导致酱油的腐败变质。该文详细阐述了酱油中存在的腐败微生物种类和由它们引起的酱油变质现象,以及通过发酵工艺优化、添加防腐剂和生物技术等手段防止酱油腐败的相应措施。最后概述了乳酸菌的抗菌代谢产物种类与抑菌特性,并讨论了乳酸菌在酱油防腐中的应用潜力,以期为开发保障酱油品质稳定和提升的方法提供经验和参考。

不透明红球菌转化合成α-酮异己酸培养基优化

利用基于统计学的方法对不透明红球菌(Rhodococcus opacus)DSM 43250转化合成α-酮异己酸(KIC)的培养环境进行优化。采用Plackett-Burman(PB)设计筛选获得对KIC产量具有显著影响的关键营养因子:(NH4)2SO4、麦芽膏和NaNO3。通过最陡爬坡实验、Box-Behnken实验设计和SAS软件回归分析建立了KIC产量关于3个关键营养因子的二次多项式模型,并以模型求解确定最佳培养条件(g/L):(NH4)2SO4 0.23,麦芽膏2.42,NaNO3 1.43。在此培养条件下,KIC的理论最高产量为23.98 mg/L,在验证实验中KIC最高产量为23.93 mg/L,比优化前(3.72 mg/L)提高了6.43倍。

微液滴适应性进化强化大肠杆菌耐受高浓度L-山梨糖

前期研究构建了1株组成型表达山梨糖脱氢酶(sorbose dehydrogenase,SDH)的大肠杆菌工程菌,该菌株能利用L-山梨糖生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KLG),但对底物L-山梨糖的耐受性较差。为解决这一问题,对该菌株进行适应性进化,并强化了进化菌株发酵生产2-KLG的能力。首先,应用基于微流控技术的全自动高通量微生物液滴培养系统,将出发菌株在不同浓度梯度的L-山梨糖培养基中生长、传代,获得能够耐受高浓度L-山梨糖的进化菌株。在摇瓶上进一步验证,最终获得了1株能耐受高浓度L-山梨糖的进化菌株2-F6。然后在2-F6中共表达了能促进2-酮基-L-古龙酸积累的山梨酮脱氢酶(sorbosone dehydrogenase,SNDH),并在摇瓶水平上对接种量、发酵温度、SNDH诱导时间、IPTG诱导浓度以及L-山梨糖添加量进化了优化,在最优条件下,2-KLG的产量达6. 05 g/L。最终,将摇瓶发酵条件放大至5 L发酵罐后,2-KLG的产量为5. 70 g/L。研究结果为一菌一步发酵法生产维生素C前体2-KLG提供了参考。

庆大霉素优良高产菌株的诱变选育研究

为得到优良的庆大霉素(GM)高产菌,以Micronozpora Echinozpora07-1为出发菌,经硫酸二乙酯(DES)和微波诱变处理,以自身代谢终产物为筛子,采取抗性平板以及摇瓶动态选育两种方式,结合薄板层析(TLC)检测进行优良突变菌株的筛选。筛选得到的产C1组分比例较高的优良突变菌株突变菌株D15,其发酵液中C1含量达到GM中的45.94%,生物效价为1400U/ml,较出发菌株提高了66.8%,并且具有良好的遗传稳定性。