马氏珠母贝丝裂原活化蛋白激酶p38的克隆与表达

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白激酶通过磷酸化级联介导的信号通路在细胞对细胞外刺激的反应中起着重要作用。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得马氏珠母贝MAPK p38(PmMAPK p38)cDNA全长序列并对其序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了PmMAPK p38在马氏珠母贝不同组织以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示,PmMAPK p38 cDNA全长为1516 bp,开放阅读框长度为1071 bp,共编码356个氨基酸,理论分子量为40.88 ku;结构域预测结果表明PmMAPK p38含有MAPK家族典型的S_TKc结构域;多序列比对、进化树构建以及MatGAT计算结果显示PmMAPK p38与其他物种的相似度、保守程度较高;荧光定量分析结果表明,该基因在马氏珠母贝中存在广泛表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为外套膜,最低是闭壳肌。马氏珠母贝在受到LPS刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在刺激后2 h达到最高,12 h降到最低,最高约为最低的5倍;而在哈维氏弧菌刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在2 h达到最高,8 h降到最低,最高约为最低的4倍。研究表明,PmMAPK p38可能在马氏珠母贝的免疫反应,尤其是在抵御外部细菌侵入中起着重要的作用。本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了基础资料。

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101bp,3′非编码区144bp和开放阅读框(ORF)591bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。

马氏珠母贝NatF基因克隆及其表达分析

【目的】掌握马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Nα-乙酰转移酶60基因(PmNatF)在不同组织、不同发育时期及不同病原相关分子模式(PAMPs)刺激下的表达变化规律,为后续研究NatF基因功能及揭示其在刺激应答中的分子机制提供理论依据。【方法】运用RACE克隆PmNatF基因cDNA序列,通过ProtScale、ProtParam、PSITE-Search、SignalP 4.1、SMART及Cell-PLoc 2.0 Package等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测PmNatF基因组织表达分布特征及其在不同发育时期和PAMPs刺激后的表达情况。【结果】PmNatF基因cDNA序列全长1142 bp,其开放阅读框(ORF)为693 bp,5'端非编码区(5'-UTR)为181 bp,3'端非编码区(3'-UTR)为268 bp,共编码230个氨基酸残基。PmNatF蛋白分子量约26.64 kD,理论等电点(pI)为8.54,总平均亲水性系数为-0.068,为不稳定的亲水蛋白;PmNatF蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,包含有N-乙酰转移酶结构域(Acetyltransf_1 domain),其亚细胞定位于细胞质。PmNatF蛋白二级结构中,α-螺旋占36.52%,β-转角占6.96%,延伸链占22.91%,无规则卷曲占33.91%;其三维结构与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的NatF蛋白结构相似。PmNatF氨基酸序列与其他物种的NatF氨基酸序列高度同源,其中与美洲牡蛎(C.virginica)和欧洲大扇贝(Pecten maximus)的NatF氨基酸序列相似性较高,分别为76.52%和75.22%。PmNatF基因在马氏珠母贝各组织中均有表达,以在性腺中的相对表达量最高;在不同发育时期也均有PmNatF基因表达,其相对表达量以卵的最高,担轮幼虫的最低。在脂多糖(LPS)刺激下,马氏珠母贝鳃组织PmNatF基因表达呈上调趋势,于刺激24 h时达最高值;在肽聚糖(PGN)刺激下,至刺激6 h时出现明显的峰值;在聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激下,则在刺激72 h时出现峰值。【结论】PmNatF基因具有较高的保守性,在马氏珠母贝各组织及不同发育时期均有表达,尤其以性腺和卵的相对表达量最高,且经PAMPs刺激后在马氏珠母贝鳃组织中呈明显的差异表达,表明PmNatF基因可能参与马氏珠母贝生殖细胞的分裂和成熟及其免疫应答过程。

马氏珠母贝Caspase-3基因克隆和组织表达分析

半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)作为细胞凋亡通路中重要的效应蛋白,在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。为初步探究马氏珠母贝Caspase-3(PmCaspase-3)的生物学功能,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmCaspase-3基因cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法分析了PmCaspase-3基因mRNA在马氏珠母贝不同组织和不同发育时期的表达差异。结果显示,PmCaspase-3基因cDNA全长为2233 bp,其中5'端非编码区长度为80 bp,3'端非编码长度为31 bp,开放阅读框长度为2088 bp,共编码695个氨基酸;生物信息学分析显示,PmCaspase-3含有Caspase家族特有的CASc结构域和半胱氨酸蛋白酶家族p20、p10活性位点以及多种磷酸化位点,经进化分析以及多序列比对可知与其他物种Caspase-3蛋白同源性较高。RT-qPCR结果表明,PmCaspase-3在肝胰腺中的表达量最高,在闭壳肌中的表达量最低;在发育过程中D型幼虫期和眼点期的表达量较高。