HBsAg阳性母亲新生儿干扰素基因刺激因子天然免疫信号通路对婴儿乙型肝炎疫苗无/弱应答的影响

目的探讨HBsAg阳性母亲新生儿干扰素基因刺激因子(STING)天然免疫信号通路对婴儿乙型肝炎(乙肝)疫苗无/弱应答的影响。方法选取2019年11月至2022年6月在太原市第三人民医院分娩的HBsAg阳性母亲及其新生儿/婴儿作为研究对象,采用问卷调查和病历查阅的方式收集其流行病学资料和临床资料,运用流式细胞术检测新生儿脐血中STING天然免疫信号通路关键分子蛋白(STING、pIRF3)以及疫苗应答相关免疫细胞(DC、T、B和浆细胞)。对全程规范接种乙肝疫苗后1~2个月的婴儿进行随访,通过化学发光微粒子免疫分析法检测随访婴儿血清抗-HBs。结合非条件logistic回归模型、列线图和贝叶斯网络模型探讨STING天然免疫信号通路和相关因素在婴儿乙肝疫苗无/弱应答中的作用与贡献大小,以及各因素间相互关系。结果共调查195对HBsAg阳性母亲及其婴儿,婴儿乙肝疫苗无/弱应答率为12.31%(24/195)。母亲HBV DNA高载量、新生儿STING蛋白低表达、pIRF3蛋白低表达和浆细胞低表达是婴儿乙肝疫苗无/弱应答的危险因素(OR值分别为4.70、3.46、3.18和2.20,均P<0.05),以上因素构建的列线图具有良好的预测效能(曲线下面积=0.81,95%CI:0.63~0.83)。贝叶斯网络模型结果显示,母亲HBV DNA高载量时,新生儿STING蛋白低表达的条件概率较高(62.50%),其pIRF3蛋白低表达的条件概率较高(58.54%),DC、T、B和浆细胞低表达的条件概率均较高(53.16%、60.20%、68.42%和57.14%)。结论母亲HBV DNA可能通过抑制其新生儿STING天然免疫信号通路及疫苗应答相关免疫细胞导致婴儿乙肝疫苗无/弱应答。

HBsAg阳性母亲PBMC HBV cccDNA对新生儿Th1/Th2型细胞因子的影响

目的探讨乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)阳性母亲外周血单个核细胞(peripheral blood monouclear cell,PBMC)中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)对新生儿辅助性T细胞1(T help cell 1,Th1)、辅助性T细胞2(T help cell 2,Th2)型细胞因子及Th1/Th2比值的影响。方法以2011年6月-2013年7月在太原市第三人民医院妇产科分娩的HBsAg阳性母亲及其新生儿作为研究对象。采用电化学发光法(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)检测HBV血清学标志物,real-time PCR-TaqMan探针法检测母亲PBMC HBV cccDNA,ProcartaPlex多因子分析技术检测新生儿外周血Th1型细胞因子白介素-2(interleukin 2,IL-2),干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-ɑ)以及Th2型细胞因子白介素-4(interleukin 4,IL-4),白介素-6(interleukin 6,IL-6)和白介素-10(interleukin 10,IL-10)水平。结果单因素分析显示:与阴性组相比,母亲PBMC HBV cccDNA阳性组IL-2、IL-6和IL-10水平升高,Th1/Th2比值降低(P=0.034;P=0.007;P=0.048;P=0.029);经阴道分娩新生儿IL-6和IL-10明显高于剖宫产新生儿,Th1/Th2比值低于剖宫产组(均有P<0.001);新生儿HBsAg阳性组IL-10水平明显高于阴性组,TNF-α水平以及Th1/Th2比值明显低于阴性组(P=0.011;P<0.001;P=0.027)。以Th1/Th2比值反映新生儿Th2优势应答程度,分析母亲PBMC HBV复制对新生儿Th2优势应答的影响,调整相关因素后,logistic回归分析结果显示母亲PBMC HBV cccDNA阳性新生儿发生Th2强优势应答的风险是母亲PBMC HBV cccDNA阴性新生儿的2.42倍(OR=2.42,95%CI:1.16~5.04,P=0.018),经阴道分娩新生儿发生Th2强优势应答的风险是剖宫产新生儿的5.06倍(OR=5.06,95%CI:2.95-8.67,P<0.001)。结论 HBsAg阳性母亲PBMC HBV复制和阴道产可能加重新生儿Th2优势应答程度,提示需注重母亲PBMC HBV复制和分娩方式对新生儿Th1/Th2型细胞因子的影响。

HBsAg阳性母亲HBV核心启动子突变与宫内传播的关系

目的分析HBV为C基因型的HBsAg阳性母亲核心启动子(BCP)区突变与宫内传播的关系。方法2011年6月至2013年7月太原市第三人民医院妇产科HBsAg阳性母亲及新生儿399对。收集一般人口学资料,采用荧光定量PCR和电化学发光法分别检测母婴血清HBV DNA及HBV血清学标志物。选择HBV DNA载量≥106 IU/ml的113例母亲为研究对象,其新生儿发生宫内传播的22例为宫内传播组,随机选取其中22例未发生宫内传播者作为对照组,母亲HBV DNA经提取、扩增、克隆、测序和序列编辑及剪接后与从NCBI下载的标准序列比对进行基因分型,最终选择C基因型的39例母亲进行突变分析。结果HBV为C基因型(88.63%)的母亲共39例,其中宫内传播组19例,对照组20例。母亲A1762T/G1764A双突变率在两组差异显著(7.53%vs.27.72%,P<0.001)。非条件logistic回归分析显示A1762T/G1764A双突变可能是宫内传播的保护因素(aOR=0.065,95%CI:0.006~0.746,P=0.028)。母亲A1762T/G1764A双突变可能与新生儿HBeAg水平有关(P=0.050)。结论HBV C基因型的HBsAg阳性母亲HBV DNA BCP区A1762T/G1764A双突变可能降低HBV宫内传播的风险。

TLR3对乙型肝炎疫苗无弱应答婴儿脐血单个核细胞 Th1/Th2型细胞因子的影响

目的探索能否通过上调乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性母亲脐血单个核细胞(cord blood mononuclear cells,CBMCs)TLR3改变其Th1/Th2型细胞因子表达水平及其程度。方法收集40例HBsAg阳性母亲脐血,分离CBMCs进行体外实验,分对照组、HBV(hepatitis B virus,HBV)刺激组和聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I∶C)+HBV刺激组。用流式细胞术和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测TLR3蛋白和Th1/Th2型细胞因子水平,以化学发光免疫分析法测定婴儿12月龄外周血抗-HBs水平判定乙型肝炎疫苗(简称乙肝疫苗)应答情况。结果经TLR3激动剂协同HBV干预后,乙肝疫苗无/弱应答者CBMCs TLR3上升37.41%,高于强应答者(22.48%)(P=0.262),Th1/Th2型细胞因子表达水平均低于强应答者(均有P<0.001)。HBV刺激可下调Th1/Th2型细胞因子表达水平,Poly I∶C+HBV刺激可上调Th1/Th2型细胞因子表达水平(均有P<0.05);经Poly I∶C+HBV刺激后,无/弱应答者γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)和白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)表达水平接近强应答者HBV刺激后的表达水平(均有P>0.05)。结论 HBV感染对HBsAg阳性母亲婴儿的免疫损伤与乙肝疫苗无/弱应答可能有关,上调CBMCs TLR3蛋白表达水平可以提高无/弱应答者Th1/Th2型细胞因子表达水平。

C基因型HBV变异与宫内传播的关系

目的分析携带C基因型HBV的母亲病毒基因组变异情况,探讨其与HBV宫内传播的关系。方法选取2011-2013年在太原市第三人民医院产科住院的399对携带HBV的母亲及其新生儿,通过问卷调查和病历查阅获得母亲及其新生儿基本情况。采用荧光定量PCR和电化学发光法分别检测母亲及其新生儿血清HBV DNA及HBV血清学标志物。新生儿出生后24 h内且主/被动免疫前,股静脉血HBsAg和/或HBV DNA阳性者判定为HBV宫内传播。按克隆测序要求,母亲HBV DNA载量须≥106 IU/ml,在54例发生HBV宫内传播者中,以满足克隆测序要求的22对母亲及其新生儿作为宫内传播组;以随机种子方法选择同等数量未发生宫内传播的母亲及其新生儿为对照组,经PCR扩增HBV DNA、基因克隆、测序,对携带C基因型HBV的母亲进行病毒基因组变异分析。结果44例样本中39例(88.63%,39/44)为C基因型,其余2例为B基因型,3例为B与C混合型。将42例携带C基因型HBV的母亲的406条克隆株进行基因变异分析,其中宫内传播组204条,对照组202条。HBV宫内传播组PreS1、S、C、P区碱基置换突变率均明显低于对照组(χ2值介于8.67~40.73之间,P<0.05);HBV宫内传播组PreC和X区碱基缺失突变率低于对照组(χ2值分别为17.82和34.78,P<0.001)。X区nt1644~1645和nt1649~1650分别存在31 bp和27 bp的插入突变,且均发生于对照组。结论携带C基因型HBV的母亲病毒基因组PreS1、S、C、P区碱基置换突变与HBV宫内传播有关;PreC区的缺失突变、X区的插入和缺失突变可能降低了宫内传播的发生风险。

HBsAg阳性母亲C基因型HBV DNA CpG岛分布特点和宫内传播的关系

目的探讨HBsAg阳性母亲C基因型HBV DNA CpG岛的类型、长度、CG位点等的分布特点及其与HBV宫内传播的关系,为HBV宫内传播机制研究提供新视角。方法连续收集2011年6月至2013年7月太原市第三人民医院妇产科住院分娩的HBsAg阳性母亲及其新生儿,通过面对面问卷调查及电子病历收集流行病学资料,采用电化学发光法和荧光定量PCR分别检测母亲及新生儿HBV血清学标志物及血清HBV DNA。以新生儿出生24 h内乙型肝炎(乙肝)疫苗/乙肝免疫球蛋白注射前股静脉血HBsAg和/或HBV DNA阳性判定为HBV宫内传播。将HBV宫内传播者中HBV DNA载量≥106 IU/ml(满足克隆测序要求)的22例母亲及其新生儿作为宫内传播组,从未发生宫内传播者中随机选取HBV DNA载量≥106 IU/ml的22例作为对照组,以HBV DNA测序分型结果为C基因型的39例母亲进行HBV DNA CpG岛分布预测等分析。结果39例HBV C基因型的母亲中,宫内传播组19例,对照组20例。39例C基因型者HBV DNA均含有传统CpG岛Ⅱ、岛Ⅲ,而对照组中有传统CpG岛Ⅰ以及新型CpG岛Ⅳ、岛Ⅴ;HBV宫内传播组和对照组母亲携带的HBV DNA CpG岛Ⅱ、岛Ⅲ长度和CpG岛ⅡCG位点个数分布不同,差异有统计学意义(P<0.05),HBV宫内传播组中CpG岛Ⅱ长度≥518 bp且其CG位点个数≥40个(11/19)的比例明显高于对照组(2/20),差异有统计学意义(P<0.05);位于X基因启动子区的CpG岛Ⅱ长度和CG位点个数大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。HBV宫内传播组中大部分母亲(12/19)携带的HBV DNA CpG岛Ⅱ完全覆盖了Xp区,明显多于对照组(5/20),且其HBV DNA Xp区CG位点个数大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论HBsAg阳性母亲C基因型HBV DNA CpG岛分布与宫内传播有关,CpG岛Ⅱ长度长、CG位点个数多可能会增加HBV宫内传播的发生风险。

外周血单个核细胞TLR3信号通路活化在重组乙型肝炎表面抗原免疫应答中的作用

目的探讨外周血单个核细胞(PBMC)Toll样受体3(TLR3)信号通路的活化在重组HBsAg(rHBsAg)免疫应答中的作用及机制。方法收集13名健康献血者外周血制备血液制品时滤除的白细胞,分离培养PBMC后分别给予TLR3激动剂聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly I:C组)及PBS(对照组)处理,48 h后收集部分细胞,采用流式细胞术检测TLR3信号通路蛋白水平;在活化(Poly I:C组)/未活化(对照组)TLR3信号通路后,采用rHBsAg处理两组PBMC 72 h,采用流式细胞术检测PBMC中树突状细胞(DC)、T、B淋巴细胞及其亚群比例。采用配对t检验、配对资料的符号秩和检验和典型相关分析进行统计学分析。结果Poly I:C组PBMC TLR3信号通路中TLR3蛋白阳性细胞百分比(19.21%)、TLR3蛋白表达量(8983.95)、NF-κB蛋白的表达量(26193.13)、磷酸化NF-κB(pNF-κB)蛋白阳性细胞百分比(13.73%)及其占NF-κB的比例(16.03%)、磷酸化IRF3(pIRF3)蛋白阳性细胞百分比(12.64%)及其占IRF3的比例(21.80%)均明显高于对照组(分别为11.54%、8086.00、22340.66、8.72%、9.71%、9.57%、19.12%)(P<0.05),TRIF蛋白阳性细胞百分比(89.75%)和蛋白表达量(304219.54)均高于对照组(89.64%、288149.72)(P>0.05);经rHBsAg处理后,Poly I:C组髓样DC(mDC)(2.90%)、浆细胞样DC(1.80%)、B细胞(5.31%)比例及浆细胞占B细胞比例(67.71%)均明显高于对照组(1.83%、0.81%、4.23%、58.82%)(P<0.05);TLR3信号通路相关蛋白阳性细胞百分比和蛋白表达量与免疫细胞之间均存在典型相关,TLR3蛋白表达量与浆细胞比例、pIRF3蛋白表达量与浆细胞和mDC比例、pNF-κB和pIRF3蛋白阳性细胞百分比与CD4+T细胞的比例均正相关。结论Poly I:C可以活化PBMC TLR3/TRIF/NF-κB和TLR3/TRIF/IRF3信号通路,促进下游信号分子发挥功能,进而促进DC的成熟,诱导CD4+T细胞免疫反应,促进B细胞的成熟分化,促进rHBsAg的免疫应答。