枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5 h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.

绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究

目的 用增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞 ,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响。方法 体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞 ,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞 ,G4 18筛选 10～ 12d ,挑选转基因单克隆细胞 ,传代培养 ,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析 ,并进行了培养细胞性别鉴定。结果 整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别 ,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量。结论 EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究 ,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础。

利用番茄U3snRNA基因上游启动区构建植物表达载体及对烟草的转化

利用番茄U3snRNA基因上游启动区和ACC合成酶反义RNA-核酶嵌合基因DNA片段,构建含U3snRNA基因上游启动区-ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列的表达载体,重组于植物双元表达载体pGA643中,得到pGU3R.用三亲融合法导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化烟草,诱导再生小植株,获得了卡那霉素的抗性植株.提取抗性植株总DNA,通过PCR、PCRSouthern杂交检测并分别用启动区序列和ACC合成酶的反义RNA-核酶嵌合序列作探针,通过Southern杂交检测,已筛选出整合有外源基因的转化植株.为进一步研究U3snRNA上游启动区增强反义RNA-核酶基因的表达奠定了基础.

枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coliBL21(DE3)plysS中的表达

用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因.利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的融合表达载体,转化E.coliBL21(DE3)plysS后经IPTG诱导在大肠杆菌中高效表达,经SDS-PAGE电泳及bandscan软件分析融合蛋白分子量约为33.4kD,约占菌体总蛋白29.4%.

绵羊乳腺特异表达hALR基因载体的构建

以绵羊β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)基因5'端0.8kb片段,作为目的基因人肝再生增强因子(Humanaugmenterofliverregeneration,hALR)乳腺特异表达启动子,人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus,CMV)启动子为绿色荧光蛋白基因(EnhancedGreenfluores-cenceprotein,EGFP)的启动子,构建了ALR基因乳腺特异表达而EGFP基因非组织特异性真核表达载体.这将为利用乳腺生物反应器生产人肝再生增强因子转基因动物及转基因早期胚胎鉴定奠定基础.

人血管抑素AK(1-3)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用6月龄大月份流产的新鲜肝脏组织为材料,提取总RNA,通过反转录得到cDNA,并以此为模板,经PCR得到人Angiostatin基因的AK(1-3)片段.将此PCR产物直接与载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α.经蓝白菌落筛选,PCR和酶切检测,筛选出阳性克隆,命名为pMDA,测序证明克隆序列与GenBank发表序列一致,大小为858bp.用Sal 和Bgl 酶切将该基因插入载体pQE40,并转化宿主菌M15[pREP4].经质粒电泳PCR和酶切检测筛选阳性克隆,得到表达载体pQEA,插入基因与载体上小鼠DHFR基因重组形成嵌合基因.在30℃,2×YT培养基(Kan25μg/mL+Amp200μg/mL),2mmol/LIPTG条件下诱导pQEA/M15[pREP4]表达.所得菌体总蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明,在预期的61kD处得到一条特异带,为AK(1-3)cDNA与载体固有基因DHFR-6хHis的重组蛋白表达产物.实验结果为抗肿瘤药物的研制提供了条件.

鼠神经生长因子生物学活性测定方法的研究

目的建立一个简单、稳定、重复性好的鸡胚背根神经节培养法测定m NGF活性的实验方法。方法通过对鸡胚运输温度控制、神经节分离和接种时间限制、培养结果观察时间摸索、活性测定的浓度范围、重复性等试验,建立了鼠神经生长因子生物学活性的测定方法。结果该方法具有操作简便,灵敏度高、重复性好、测试结果准确的特点。结论采用鸡胚背根神经节培养法可有效测定鼠神经生长因子的生物学活性。

人肝再生增强因子和荧光蛋白基因在绵羊成纤维细胞中的表达

本实验利用LipofectAMINETM介导pEGFP/ALR载体转染sFFCs,经G418筛选,10d后共形成38个单克隆细胞,细胞用于提取蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫组化检测。结果表明:3个荧光单克隆细胞,聚丙烯酰胺凝胶电泳可见与预期相符的57KD大小的融合蛋白,免疫组化检测可见ALR蛋白分布于sFFCs胞质和胞核,且细胞核含量多于细胞质。

鼠神经生长因子随机双盲安慰剂对照ⅠⅡⅢ期临床试验中注射部位疼痛的综合分析

目的分析注射用鼠神经生长因子致局部疼痛的原因和影响因素。方法采用随机、双盲、安慰剂平行对照设计进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验。结果肌注鼠神经生长因子,常见不良反应为注射部位肌肉疼痛,临床推荐剂量15000AU,健康受试者8例中4例出现疼痛,Ⅱ期临床试验视神经挫伤患者注射局部疼痛发生率32.56%(14/43),Ⅲ期临床为12.83%(39/304),无严重不良事件。结论注射部位疼痛是很常见的不良反应,由鼠神经生长因子引起,呈剂量依赖性,与赋型剂及溶媒无关,强的松或可减缓疼痛,视神经挫伤患者对临床推荐剂量一般可以耐受。

注射用鼠神经生长因子制备方法的优化

目的优化注射用鼠神经生长因子的制备方法。方法首先对注射用鼠神经生长因子冻干赋形剂的种类进行筛选,根据筛选结果对赋形剂组分比例开展进一步研究,优化冻干工艺,采用经优化的处方、冻干工艺制备注射用鼠神经生长因子样品,并对样品的关键质量属性开展稳定性研究。结果使用单一赋形剂不能达到良好的冻干效果,而当混合使用甘露醇和右旋糖酐40两种赋形剂,且其比例为4∶1时,即使在减少人血白蛋白用量情况下,也能获得冻干时间短且成型良好的冻干产品,且稳定性符合质量标准要求。结论该优化的制备方法有效地缩短了注射用鼠神经生长因子冻干步骤的耗时,提高了生产效率,同时可保证产品的稳定性良好,保障临床用药安全有效。

鼠神经生长因子病毒灭活效果的验证

目的对鼠神经生长因子（mouse nerve growth factor,mNGF）病毒灭活工艺进行验证。方法以伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）和Sindbis病毒为指示病毒,考察辛酸钠法对mNGF原液中病毒的灭活效果,并比较灭活后与未灭活原液的mNGF活性、纯度、等电点及其-20℃贮存0、3、6个月的稳定性。结果 mNGF原液经0.3%辛酸钠、pH（5.0±0.2）、（25±1）℃灭活90 min,PRV和Sindbis病毒滴度均下降6 lgCCID50/ml以上,灭活60、90 min样品盲传3代后,均未检测出病毒。灭活后与未灭活原液的mNGF活性无差异,比活性均在5.0×10^5 AU/mg以上,蛋白纯度均为100%,等电聚焦主区带均在8.65～9.30之间;-20℃贮存0、3、6个月,蛋白纯度均为100%,比活性均无明显差异,且6个月内比活性均未明显降低。结论辛酸钠法可安全、快速、高效地灭活mNGF原液中的指示病毒及其所代表的相关病毒,保证了产品的质量及其工艺的稳定性,保障了临床用药的安全性。