改良分子信标-实时PCR快速检测副溶血弧菌

目的 :建立改良分子信标 -实时 PCR检测副溶血弧菌的快速方法 ,应用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法 :根据 Gen Bank公布副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因 (TDH)的保守序列 ,设计一对引物和改良分子信标探针 ,用 FAM荧光剂标记探针的 5′,并进行特异性和灵敏度分析 ;同时以 11种细菌作对照 ,建立改良分子信标检测副溶血弧菌的实时 PCR反应体系 ,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果 :检测 12种细菌 ,只有副溶血弧菌有荧光信号 ,与其他细菌无交叉反应 ,DNA灵敏度为 16 6 .6 fg/ μl,菌液灵敏度为 6 9cfu/ ml或 6 cfu/ PCR反应体系。改良分子信标 -实时 PCR反应体系检测 4 0株副溶血弧菌均出现特异的荧光信号 ,无干扰。对 3起细菌性食物中毒共 4 8份样品和 10 0份海产品进行检测 ,9份副溶血弧菌实时 PCR阳性 ,其中 7份副溶血弧菌细菌培养阳性 ,其余样品都为阴性。检测时间仅需 2 h。结论 :改良分子信标 -实时 PCR检测体系快速、灵敏度高 ,特异性强 ,可用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断 。

改良分子信标-双重实时荧光PCR快速检测SARS病毒

目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒的方法,用于SARS的早期诊断和动物溯源。方法利用改良分子信标技术、装甲RNA和双片段双色荧光技术,根据GenBank公布的SARS病毒聚合酶基因1b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,以部分临床标本的酶联吸附实验结果和传统细胞培养方法作为对照,建立分子信标检测SARS病毒的方法。对368份临床标本(咽漱液、血液、粪便、尿液)、52份细胞培养液和50份动物标本进行荧光PCR扩增。结果分子信标检测SARS病毒的方法灵敏度为10～100个拷贝ml,与流感病毒等呼吸道病毒无交叉反应。分子信标检测368份临床标本,20份阳性。其中确诊病例阳性率为21.27%(1047),确诊病例的咽漱液阳性率为43.48%,还分别从粪便和血清中检测到SARS病毒。52份细胞培养液,29份阳性,阳性率为55.77%。50份动物标本,23份阳性,阳性率为46%。结论改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源。

核酸脉冲电泳场技术在霍乱分子流行病学调查中的应用

目的 :对深圳市某一霍乱疫点进行流行病学调查和传染来源追踪。方法 :采用病原学方法和核酸脉冲电泳场技术 ,分析霍乱阳性菌株的酶切图谱 ,并比较图谱的差异。结果 : 同一疫点的 5株霍乱阳性菌株均表现为 DNA片段大小一致和数量相同的电脉图谱。结论 :5株菌株为同一克隆的流行株。核酸脉冲电泳场分析技术适用于分析菌株的同源性和传染来源追踪。

16srDNAPCR鉴定术后龟分支杆菌脓肿亚种的爆发感染

采用分子生物学技术 ,从基因水平上诊断此次术后爆发感染的致病菌。根据分支杆菌的 16srDNA序列 ,设计合成一对引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,并以结核分支杆菌、龟分支杆菌龟亚种和偶然分支杆菌做对照 ,对5 3株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株进行PCR扩增。在此基础上 ,采用 16srDNAPCR扩增体系检测 2 5 9份临床标本。结果 5 3株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株均被扩增出一条特异的 5 84bpDNA带。 2 5 9份临床标本 ,PCR扩增阳性率为 62 9%。

膜免疫层析一步法在霍乱弧菌诊断中的应用

目的 :应用膜免疫层析 (免疫沾棒 )快速诊断 0 1群霍乱弧菌。方法 :采用病原学方法和免疫沾棒对 30 9份标本和 2 0株霍乱阳性菌株进行平行检验。结果 :免疫沾棒的灵敏度为 10 u 个 / ml菌液 ,免疫沾棒特异性强。结论 :目前的膜免疫层析试剂不适于临床快速诊断 ,仅仅只能作为一种辅助诊断技术用于外环境的监测和临床标本的诊断。

53株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株的同源性研究

目的 分析引起院内感染爆发的 5 3株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株的同源性。方法采用核酸脉冲电泳场分析技术 ,分析 5 3株临床分离株酶切电泳图谱 ,并比较图谱的差异。结果 5 3株临床分离株出现两种电泳图谱 ,49株临床分离株为相同的电泳图谱 ,4株临床分离株表现为另一种电泳图谱。结论 分子水平上确认院内术后龟分支杆菌脓肿亚种感染爆发主要是由同一传染来源引起。

公共场所集中空调通风系统污染与卫生学评价

目的 调查评价公共场所集中空调通风系统污染状况 ,为卫生管理提供依据。方法 随机抽取深圳市各类公共场所 2 0个集中空调通风系统 ,检查各部件清洁度 ;检测冷却塔水中军团菌、空调送风中可吸入颗粒物(PM10 )、细菌总数、真菌总数、溶血性链球菌含量。结果 2 0个空调系统的 2 5 0个部件中 ,有 2 4 %有尘粒 ,5 %有污垢 ,未发现菌霉斑 ;空调送风中污染物的平均日均值分别为 :可吸入颗粒物 (PM 10 ) 0 12mg/m3 ,细菌总数 2 91cfu/m3 ,真菌总数 2 73cfu/m3 ,未检出溶血性链球菌 ;分别有 10 % ,5 %的空调系统送风中可吸入颗粒物 (PM10 )、细菌总数超标 ;采集 4 9份冷却塔水样 ,未检出军团菌。结论 公共场所集中空调通风系统仍存在卫生问题 。

深圳市空调冷却塔水军团菌污染状况调查

目的了解深圳市宾馆、大型写字楼、地铁等各类建筑物的空调冷却塔水军团菌污染状况。方法随机采集中央空调冷却塔水样品并进行细菌培养和鉴定,再以聚合酶链式反应(PCR)等方法加以验证。结果共采集水样28件,分离到1株军团菌,经鉴定为嗜肺军团菌Lp1型。结论深圳市中央空调冷却塔存在军团菌的污染,需引起重视,防止军团菌病发生。

深圳市细菌性食物中毒病原菌的调查与预防

目的了解深圳市近年引起细菌性食物中毒常见病原菌的种类、特点和趋势，为检测和预防控制细菌性食物中毒提供科学依据。方法根据《中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法》微生物学部分对深圳市2003-2005年细菌性食物中毒检测致病菌资料进行统计分析。结果在3a中报告的63起细菌性食物中毒中依次是以副溶血弧菌（39．7％）、变形杆菌（15．9）、沙门菌（12．7）、金黄色葡萄球菌（11．1％）、蜡样芽胞杆菌（3．2％）为主要致病菌。结论深圳市为沿海城市，细菌性食物中毒病原菌以副溶血弧菌、变形杆菌为主，今后在对食品污染监测时，可重点监测上述致病菌，开发快速检测方法，这样可为预防、处理和治疗食物中毒赢得时间，确保食物中毒病人及时得到治疗，保障病人的安全和身体健康。

深圳市食品中单核细胞增生性李斯特菌的污染状况调查

目的了解深圳市食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的污染状况,并评价不同方法的检测效果。方法分别用传统分离培养方法和荧光PCR方法进行分离培养及检出鉴定。结果从178份样品中检出3份(株)单核细胞增生性李斯特氏菌,检出率为1.68%。结论深圳市食品中存在单核细胞增生性李斯特氏菌污染的危险,需加强食品中单核细胞增生性李斯特氏菌监测。用传统方法结合荧光PCR方法能提高单核细胞增生性李斯特氏菌的检出率和准确性。

副溶血弧菌脉冲场凝胶电泳技术分子分型分析

目的分析副溶血弧菌菌株之间的相关性,建立深圳市副溶血弧菌的DNA指纹图谱数据库。方法56株副溶血弧菌基因组DNA经NotI酶切,通过脉冲场凝胶电泳获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果56株副溶血弧菌被分为34种脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)图谱,聚类分析显示,在90%的相似性水平上,28株细菌谱型属于同一个群,其中27株均为食物中毒患者分离株,并各年度均有分离。结论深圳地区存在遗传谱系紧密相关的副溶血弧菌流行克隆。建立DNA指纹图谱数据库为建立分子分型监测网络打下了良好的基础,有助于副溶血弧菌所致食源性疾病的及时主动监测和传染来源追踪。

荧光定量PCR和DNA分子分型在菌痢暴发中的应用

[目的]探讨实时荧光PCR快速检测和脉冲肠凝胶电泳(PFGE)分型方法在菌痢暴发流行病学研究中的应用。[方法]采用实时荧光PCR检测技术对一起菌痢患者的24份肛拭增菌液进行快速检测,同时从患者肛拭中分离的5株福氏4型志贺氏菌采用脉冲场凝脉电泳的方法进行了分子分型。[结果]在这一起菌痢疫情中,实时荧光PCR快速检测24份肛拭增菌液,5份阳性,并从PCR阳性的增菌液中分离到5株福氏4型志贺氏菌,而且5株志贺氏菌的脉冲场凝胶(PFGE)图谱显示DNA条带完全一致,具有高度的同源性。[结论]实时荧光定量PCR技术特异性强,灵敏度高,能在采样后数小时内检测到病原菌的DNA,达到快速诊断的目的。PFGE具有分型能力强,重复性好等特点,能直观地判断致病菌的亲缘关系,及时查明暴发流行的传染源从而有效控制疫情的蔓延,在志贺氏菌的分子流行病学研究中具有重要作用。

深圳市伤寒PulseNet数据库的初步建立与应用

[目的]建立深圳市伤寒PulseNet数据库,用于伤寒的实时监测和分子流行病学调查。[方法]采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术,对深圳市2002～2005年106株伤寒的染色体DNA进行酶切,用BioNumerics软件对PFGE分型图谱电子化数据分析,建立分子分型数据库。[结果]深圳市各年的伤寒菌株变异较多,呈现30多种PFGE图谱。同一起伤寒暴发的临床分离株具有相同的PFGE图谱。[结论]深圳市伤寒PulseNet数据库的初步建立,对直观地分析各起疫情之间的相互关系,对疫情的控制和传染来源的追踪具有重要意义。

荧光PCR和PFGE在副溶血弧菌食物中毒诊断中的应用研究

[目的]探讨荧光PCR和脉冲场电泳(PFGE)在副溶血弧菌食物中毒调查中的应用。[方法]对中毒样品进行荧光PCR检测,副溶血弧菌临床分离株基因组DNA经NotI酶切,通过PFGE获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。[结果]部分样品荧光PCR检测结果呈阳性,同起食物中毒菌株PFGE图谱一致。[结论]荧光PCR可以快速准确的鉴定病原体。PFGE具有很强的菌株同源性分析能力,适用于食物中毒病原菌学鉴定和传染源溯源。荧光PCR和PFGE在食物中毒的快速诊断中可发挥重要作用。

应用RT-PCR方法检测人与动物的SARS冠状病毒

目的选择合适的RTPCR检测方法应用于人和与人类生活密切相关的多种野生、圈养和市售动物携带SARS样冠状病毒的检测,探索SARS样病毒的来源。方法收集深圳SARS临床诊断病例、疑似及观察病例咽漱液标本共350份,分别用TaqMan和分子信标荧光RTPCR法进行检测;收集386只动物的咽肛拭子样本及病毒分离培养物共442份样品进行了TaqMan荧光RTPCR和普通RTPCR法的检测。结果41例临床确诊病例荧光RTPCR法检出10份阳性,阳性率24.39%,TaqMan法和分子信标法检出结果8份符合(符合率88.89%)。对动物样本病毒分离培养物细胞病变样本18份进行检测,检出16份阳性,其中14份(87.5%)样本来源为果子狸。深圳东门市场及广东周边地区市场及养殖场动物样本检测结果:果子狸、貉及獾类动物总的阳性率为39.02%,而其它动物的阳性率为0,两者间差异具有显著性(P<0.01);对东门市场109只主要野生动物咽肛拭子样本进行PCR检测,阳性率44.04%,而145只野外的野生动物阳性率仅为0(P<0.01)。结论TaqMan法和分子信标法均可用于SARS检测;动物中尤其是果子狸等野生动物可能携带有SARS冠状病毒。

改良分子信标-实时PCR快速检测志贺菌

目的:建立改良分子信标-实时PCR检测志贺菌的快速方法,应用于志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。方法:根据GenBank公布志贺菌ipaH基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR-改良分子信标检测体系,应用于对志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为93 fgμ/l,菌液灵敏度为64 cfu/m l或2 cfu/PCR反应体系,无交叉反应。此反应体系检测67株志贺菌,均出现特异的荧光信号。对细菌性食物中毒样本等共657份样品进行志贺菌检测,42份志贺菌实时PCR阳性,其中41份志贺菌细菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需2 h^1 d时间。结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于志贺菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段,对于提高肠道门诊的工作效率有重要意义。

不典型山夫登堡沙门菌流行菌株的鉴定

目的对新出现的硫化氢(H2S)阴性山夫登堡沙门菌流行菌株进行鉴定。方法比较腹泻患者分离的山夫登堡沙门菌落、生化、耐药表型和沙门菌毒力岛1(SPI-1)的编码基因表型(hilA、invA),使用Riboprinter(进行核糖体指纹图谱分型,脉冲凝胶电泳(PFGE)选用XbaⅠ限制性内切酶,聚类软件选用BioNumerics软件。结果 2006年30株山夫登堡沙门菌腹泻菌株中,确认12株属于H2S和hilA、invA基因均阴性的表型不典型菌株;所有菌株除对四环素有较高耐药性(75.6%)外,对其他测试抗菌药物均较敏感;Riboprinter(核糖体分型图谱证实不典型与典型山夫登堡沙门菌在遗传学上属独立的克隆;PFGE分型将34株腹泻株分成16个带型,11株不典型菌株间存在90%的遗传学同源,优势带型为6型(6株)和4型(3株);13株典型菌株间有80%的遗传学同源,优势带型为17型(5株)、23型(5株)和11型(3株),不典型与典型菌株分别聚类成2个克隆族。结论生化、基因表型和遗传学特征不典型的山夫登堡沙门菌构成了2006年上海市山夫登堡的多点暴发病例,建议使用经过优化的常规和分子生物学方法以避免临床实验室对表型不典型沙门菌株的漏检。

抽检与送检桶装纯净水微生物污染的调查研究

目的研究分析抽检与送检桶装纯净水微生物污染的结果差别和卫生质量。方法对深圳市桶装纯净水的各种产品随机抽检280份;商场、超市和企业等主动送检桶装纯净水各种产品121份,采用国标标准进行微生物指标的各种检测,按国家微生物卫生标准评价。对二组结果进行比对分析研究。结果抽检的280份桶装纯净水合格率为74.3%;送检的桶装纯净水合格率为90.1%,经统计学处理两者有统计学意义(χ2=12.73,P﹤0.001)。结论抽检桶装纯净水合格率明显低于送检桶装纯净水的合格率,且两者的差别有统计学意义,说明桶装纯净水存在潜在的安全隐患,并威胁着市民的饮水安全。

新生儿重症监护病房医院感染肺炎克雷伯菌耐药性与同源性分析

目的:对新生儿重症监护病房(NICU)医院感染病例的临床及环境采样标本进行病原学分离培养和鉴定,测定菌株对常用抗菌药物的耐药性及其同源性,为控制肺炎克雷伯菌院内感染暴发流行提供科学依据。方法:临床及环境采集标本中分离的7株肺炎克雷伯菌,采用VITEK2 COMPACT全自动微生物分析系统进行耐药性测定,并进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)基因分型,明确其同源性。结果:除7号菌株外,另6株肺炎克雷伯菌均为多重耐药菌,且PFGE分析具有同源性。结论:NICU病房临床分离的7株肺炎克雷伯菌中有6株具有同源性,证实是一次院内感染暴发流行,环境污染和接触传播是造成此次感染的主要途径。因此采取及时有效的消毒隔离措施,对控制医院感染暴发流行具有重要意义。