基于CRISPR/Cas9技术PCSK9基因敲除小鼠模型的构建及表型验证

目的基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,针对PCSK9基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵,获得F0代敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)纯合子小鼠。采用PCR方法对PCSK9 KO小鼠进行基因鉴定,Western Blot检测肝组织PCSK9及低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白的表达,同时检测心、脑、肾、脂肪组织中的PCSK9蛋白表达水平,q-PCR检测PCSK9的mRNA表达水平。采用酶法检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。结果PCR产物凝胶电泳以及PCSK9蛋白及mRNA表达结果表明成功获得全身性PCSK9基因敲除小鼠,肝组织LDL-R(3.42±0.56)蛋白表达显著增高。与WT组相比,PCSK9小鼠血清TC(90.75±17.81 mg/dL vs 54.19±2.42 mg/dL)、TG(81.26±11.98 mg/dL vs 50.92±11.93 mg/dL)显著降低(P<0.001)。结论基于CRISPR/Cas9技术成功构建获得PCSK9基因敲除小鼠,敲除PCSK9基因通过上调肝脏LDL-R蛋白显著降低血脂水平。

PPARα基因敲除诱导小鼠肝脏脂质蓄积的作用研究

目的探讨PPARα基因敲除(PPARαKO)对小鼠肝脏脂质蓄积的影响。方法普食喂养至4月龄的雄性野生型小鼠(WT组)和PPARα基因敲除小鼠(PPARαKO组),各8只。称量两组小鼠体重、肝脏湿重。酶法测定肝脏及血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。HE染色观察肝脏组织的病理学变化,油红O染色检测脂滴堆积程度。Western Blot检测PPARα及其脂肪酸转位酶(CD36)、花生四烯酸ω羟化酶(Cyp4a14)以及脂滴包被蛋白2(Plin2)的蛋白表达。结果与WT小鼠相比,PPARαKO小鼠体重、血清和肝脏中TC水平差异无统计学意义(P>0.05),肝脏湿重、肝脏指数、血清和肝脏中TG水平均显著增加(P<0.01)。HE染色和油红O染色结果显示,PPARαKO小鼠呈现明显的肝细胞肿胀和肝脏脂质蓄积。Western Blot结果显示,与WT小鼠比较,PPARαKO小鼠肝脏中CD36和Cyp4a14的表达均显著降低,Plin2的表达显著增高,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论PPARα基因敲除后,通过降低CD36和Cyp4a14蛋白表达,上调Plin2蛋白表达,诱导肝脏脂质蓄积,说明PPARα具有抑制肝脏脂质沉积的功能。