鸡滑液囊支原体的流行调查及不同地区分离株药物敏感性分析

为了解近年来鸡滑液囊支原体感染的流行情况,自 2015年1月-2017年12月,对广东、广西、江苏、浙江、福建等地10个不同地区养殖场的感染情况进行调查分析。结果显示,该病在调查的10个不同地区均有发生,感染鸡群多见于 l ~ 4月龄,平均感染日龄为 60日龄;8 个不同品种鸡的平均感染率为 8.89%,平均死亡率为 2.16%。感染率和死亡率均存在品种差异,其中 817 肉杂鸡及清远麻鸡的感染死亡率最高。从157 份疑似鸡滑液囊支原体感染鸡的病料中分离到 96 株田间流行株,各地区随机取1 株进行10种常用抗菌药物的敏感性测定。结果表明,10株临床分离株均对泰妙菌素、泰万菌素、泰乐菌素及多西环素较为敏感,对金霉素、庆大霉素等的敏感性显著下降且出现不同程度的耐受性,对盐酸环丙沙星、沙拉沙星敏感性较差,此结果可为临床合理用药提供参考。

鸭瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主亚细胞中的定位分析

根据笔者实验室新发现的鸭瘟病毒(DPV)dUTPase基因(GenBank登录号DQ486149)序列设计1对引物,PCR扩增后将产物亚克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得表达质粒pET32a-DU。然后将其转化至E.coliBL21(DE3)进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约66.8 ku,与预期表达蛋白大小一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的36.2%,主要以包涵体的形式存在。重组蛋白纯化后制备兔抗血清,间接ELISA效价为1∶409 600。通过免疫荧光技术进行DPV dUTPase亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4 h的胞质中检测到特异性荧光,12 h大量点状绿色荧光聚集于胞核;24 h后胞核内点状荧光减弱,而胞质点状荧光增强;48 h胞核和胞质荧光均显著减弱。本研究为DPV dUTPase基因功能和DPV致病机理的研究提供了重要数据。

病毒dUTPase研究进展

脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase,dUTPase)广泛存在于真核、原核细胞和病毒等生物有机体中,通过催化水解脱氧尿苷三磷酸(dUTP),减少尿嘧啶在DNA合成中的错误掺入,降低细胞中的dUTP/dTTP比例,保证DNA复制的正确性和顺利进行。病毒编码的dUTPase具有种属特异性,且与病毒的毒力和高效复制密切相关。本文就dUTPase的生物学功能、分类特征、表达调控、分布定位及病毒dUTPase功能的研究进展进行了概述,为深入开展dUTPase功能研究提供理论基础。

鸭瘟病毒dUTPase基因的分子特性及转录时相分析

应用大量生物信息学分析工具及 RNA 斑点杂交技术对本实验室构建鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)CHv 株基因文库时新发现的 dUTPase 基因(GenBank 登录号DQ486149)进行了分子特性及转录时相分析。研究表明:该基因大小为1344bp,编码447个氨基酸,包含 dUTPase 家族蛋白的5个保守 motifs,排列形式3-l-2-4-5具备Ⅱ型 dUTPase的典型特征。DPV CHv dUTPase 基因在25个疱疹病毒参考株之间高度保守,并与 a 疱疹病毒的氨基酸同源性较之与β、γ疱疹病毒要高。DPV CHv dUTPase基因转录检测发现DPV 感染宿主细胞后最早30rain 可检测到该基因转录产物,随后转录产物量迅速放大,4h达高峰,24h 后下降至相对低的水平。该研究为阐明病毒基因表达调控机理提供了有用的实验数据,并对病毒其他基因的发现和研究具有指导性意义。

血清4型禽腺病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

根据多个GenBank登录的血清4型禽腺病毒株hexon基因序列,经多序列比对分析选取高度保守区域设计特异性引物探针,建立了检测FADV⁃4的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法扩增产物长度为71 bp,在101~107 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.995,初始模板最低检测下限为7.3×101 copies/μL质粒DNA,与常规PCR相比灵敏度高约1000倍。以H9亚型流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管病毒、传染性法氏囊病毒、网状内皮增生病毒、白血病病毒、减蛋综合征病毒、传染性贫血病毒核酸为模板时,均检测不到荧光信号,批内和批间重复性试验变异系数均不超过2%,具有良好的特异性和重复性。本文建立的方法可为FADV⁃4的早期感染诊断及定量分析提供有效技术手段。

应用宏基因组学鉴定国内第一株鸭2型腺病毒

为分离鉴定广东某养鸭场疑似"肝坏死"病例的病原,本研究将采集的病料样品感染番鸭胚及番鸭胚成纤维细胞(MDEF)进行病原分离,提取出现细胞病变培养物的核酸,采用宏基因组学方法,以随机引物反转录并合成双链DNA进行PCR扩增,扩增产物进行分子克隆和测序分析。结果显示:F6代分离的病毒滴度为log10^(5.0)TCID_(50)/m L,能够导致9日龄~11日龄番鸭胚死亡及MDEF产生明显细胞病变。50个随机克隆经Gen Bank检索有28个为鸭2型腺病毒(DAd V-2)同源序列,核苷酸同源性为92%~99%。28个同源序列形成8个毗连序列群,共计15 107 bp,覆盖DAd V-2基因组全长的34.54%,分离株与Gen Bank中唯一的DAd V-2 GR分离株亲缘关系最近,其部分hexon基因编码的氨基酸同源性为83.3%。参照测定序列设计的引物能够特异性扩增病毒基因。本研究首次应用宏基因组学分离获得国内首株DAd V-2,也是迄今除了法国以外国内首次报道的DAd V-2分离株。

免疫鸭群中一株变异型番鸭呼肠孤病毒的分离与特性研究

本研究从广东省某发病番鸭场分离得到的呼肠孤病毒(DRV)混合有番鸭细小病毒(MDPV)疫苗株。采用MDPV阳性血清中和后,经2轮番鸭胚有限稀释克隆获得纯化的DRV。电镜观察病毒粒子呈球形、无囊膜、双层衣壳、直径约70 nm。F6代病毒滴度为log107.5TCID50/0.1 mL,病毒能够致番鸭胚成纤维细胞产生细胞病变,并能够致死番鸭胚和SPF鸡胚,回归1日龄雏番鸭出现典型的肝脏点状或斑块状出血等特征性病变,与临床发病鸭相同。分离株S3基因核苷酸同源性与太湖流域2011年分离株DRV-TH11最高,为99.9%,与福建番鸭源分离株MDRV-J18为98%;与早期MDRV在66.8%～67.2%之间,处于不同进化分支上。本研究分离株对番鸭胚、SPF鸡胚及雏番鸭致病力强,而且其基因序列比早期分离株变异较大,应加强监测并及时筛选新疫苗株以有效防控该病的发生和蔓延。

番鸭1型病毒性肝炎病毒ZJX株分离鉴定及其3D基因序列分析

本研究从广东某养鸭场发病雏番鸭肝脏中分离到1株病毒。利用RT-PCR、基因序列分析、病毒中和试验及动物回归等鉴定为1型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-1)。3D基因序列分析显示,该毒株与2011年分离自黑龙江的1型DHV Du/CH/LGD/111238和Du/CH/LGD/111239分离株核苷酸同源性最高,达99.6%。分离株F3代尿囊液病毒价为105.5ELD50/0.2 mL,能够被DHV-1阳性血清中和。接种病料研磨上清的鸭胚在接种后3 d～5 d内全部死亡,胚体充血萎缩侏儒。该分离株人工感染3日龄雏番鸭表现为角弓反张和肝脏肿大出血等与临床病症。结果表明该分离株具有较强的致病性。

Ⅰ群禽腺病毒血清4型广东株的分离鉴定及分子特性

【目的】对广东地区疑似心包积液–肝炎综合征患病鸡进行腺病毒分离鉴定并研究其分子特征。【方法】采集的病料样品,通过鸡胚有限稀释法经SPF鸡胚传代分离纯化病毒,进行致病性试验,并对病毒的hexon、fiber-2、ORF19和ORF29基因进行PCR扩增,分析其分子特征。【结果】hexon基因序列分析显示此次分离的毒株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型(命名为WM-XC株),SPF鸡接种分离毒株后,致死率达90%,死亡鸡只出现明显的心包积液、肝炎等变化,肝脏病理切片可观察到明显的嗜酸性包涵体,显示分离毒株具有致病性。fiber-2基因序列同经典毒株ON1和KR5相应序列的相似性达96.1%和97.0%,与2015年以来国内分离的毒株序列相似性则达到100%;ORF29序列与2013年国内分离到的毒株JSJ13和JN13的相应序列相比存在33个碱基的缺失;WM-XC分离株与2015年以来国内分离毒株序列相同,但相比经典株ON1和KR-5,缺失ORF19序列。【结论】此次从广东地区分离到的血清4型Ⅰ群腺病毒,和近年国内其他地区分离的流行毒株一样,其fiber-2、ORF19和ORF29基因序列与经典毒株差异明显。

鸭瘟病毒VP26基因克隆和分子特性分析

利用作者实验室已构建的DPV CHv株基因文库重组质粒的DNA测序信息,结合NCBI的ORF Finder和BLAST工具分析得到了编码该病毒VP26蛋白基因(UL35)的ORF,然后采用PCR扩增出了VP26基因并将其克隆到pMD18-T载体上,经PCR和酶切鉴定以及进一步的核酸斑点杂交试验证实该基因即为DPV的VP26基因。分子特性分析表明:该基因大小为354 bp,编码117 aa,包含1个保守结构域,为Herpes_UL35,与小衣壳蛋白家族相关并在Herpes_UL35基因编码蛋白之间高度保守,而且DPVVP26蛋白与GenBank上多种α疱疹病毒同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析表明,DPV在分类地位上归属于Alphaherpesvir-us亚科,而且有可能属于新的属。另外,亚细胞定位分析表明,VP26主要定位于细胞核中。密码子偏爱性分析结果显示,编码VP26相同氨基酸的不同密码子使用频率有较大的差异,DPV VP26与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用偏爱性差异分别有18、19和25个。上述研究结果为进一步研究DPV VP26蛋白的功能和作用机理提供分子生物学依据。

不同PRRSV毒株间ORF1a基因密码子偏爱性差异分析

运用Codon W、ClustalX、TreeView软件及EMBOSS(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)、CIMMiner在线分析软件对选取的29株PRRSV ORF1a基因进行密码子偏爱性聚类分析.CAI、CBI、Fop、Nc、GC3s和GC含量、基因长度等相关性分析显示PRRSV各毒株编码的ORF1a基因密码子偏爱性各有差异,其中Lelystad virus、LV4.2.1、VR-2332、RespPRRS MLV与国内分离的高致病性PRRSV变异株之间差异较大.密码子使用概率聚类分析表明CC-1、NVSL-97-7895、CH-1a、RespPRRS MLV、LV4.2.1、Lelystad virus与高致病性PRRSV变异株距离较远,而国内分离株相互间的聚类距离则较接近,此结果与基于氨基酸序列比对构建的系统进化树图谱基本一致.由此可见,PRRSV病毒ORF1a基因密码子使用偏爱性的差别与病毒的遗传多样性密切相关.

仔猪先天性震颤发生原因及防制

仔猪先天性震颤是指仔猪出生不久即出现的一种全身或局部肌肉阵发性挛缩的疾病。一窝仔猪中有的部分发病，有的整窝发病，其发病死亡率可达100％.

PRRSV非结构蛋白2中B细胞线性表位分析

为了筛选出理想的PRRSV标记疫苗血清学阴性标记候选物,选取美洲型PRRSV的1株国内变异株——太平株（TP）为研究对象,通过生物学软件预测TP株Nsp 2中可能存在的B细胞线性表位（B-cell lin-ear epitopes BLE）。利用8头猪的PRRSV TP株抗体阳性血清和Peptide-ELISA方法进一步筛选确认,分析其保守性、免疫源性和免疫反应性。结果显示,在预测的27个BLE中有11个可以与50%~100%的抗体阳性血清产生阳性反应,这些BLE在攻毒后15~22 d的血清中便可以检测到对应的抗体,并且一直持续到攻毒后90 d。在筛选出的11个BLE中有9个与已经确定的BLE有不同程度的重叠区域,2个为新发现的BLE,分别为3-KV10（K243TNRATPEEV252）和11-LN11（L43KRYSPPAEGN53）。其中12-PD15（P76ERVRPS-DDWATDED90）和3-KV10（K243TNRATPEEV252）的保守性、免疫源性和免疫反应性都相对较好,是比较理想的血清学阴性标记候选物,对PRRSV标记疫苗的进一步研制具有较高的参考价值。

猪繁殖与呼吸综合征病毒TP株P4、P60、P90基因组遗传变异分析及动物致病力试验

本研究旨在对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TP株P4、P60、P90三个代次毒株进行全基因组序列测定,分析其遗传变异特性。通过分段RT-PCR、5′RACE和3′RACE法扩增病毒基因组,并运用生物信息学软件和动物致病力试验进行相关分析。结果表明:TP株P4、P60、P90株基因组全长分别为15346、15394和15393bp。3个代次病毒的基因组序列中ORF1a基因和3′-UTR区域变异较大,尤以Poly(A)尾序列碱基数差异显著,分别为26、74和73bp。3代次毒株基因组序列比对发现TPP90与TPP4差异较大,共有58个核苷酸位点和27个氨基酸位点发生突变,P90GP5蛋白抗原指数和表面亲和力与TPP4和TPP60相比呈增加趋势,动物致病力试验表明TPP4毒株致病力较TPP60和TPP90强。结果提示:TPP4、P60、P903代次毒株基因组序列存在着一定的差异,主要集中在4～60代致弱阶段,遗传进化关系上该病毒分属于PRRSV美洲株分支,并与高致病性PRRSV JXA1株亲缘关系最为接近,相似性高达99.5%、99.2%和99.3%。

我国猪繁殖与呼吸综合征流行概况

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是目前危害世界养猪业最严重的传染病之一,并在我国广泛流行。2006年我国出现的美洲型高致病性PRRS病毒(PRRSV)变异株,更是对我国养猪业影响极大。论文概述了近年来我国PRRS的流行特点,对血清学及病原学方面的调查数据进行了统计分析,并对PRRSV分子流行病学进行了探讨。

一株猪葡萄球菌的分离鉴定

从患有渗出性皮炎的仔猪分离到1株革兰阳性球菌,生化试验、形态学观察进行初步鉴定,然后进行16 S rRNA基因片段的扩增和测序,将测序结果与GenBank上的已知序列进行同源性比较,结果与猪葡萄球菌的核酸序列同源性达到99.6%,综合可见该分离菌株为猪葡萄球菌,并将其命名为GDSH1。

猪繁殖与呼吸综合征病毒TM株的分离鉴定及其Nsp2序列分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的变异特点,本研究从广东省某猪场患有明显呼吸道症状的仔猪肺脏组织中分离到一株病毒,利用RT-PCR、基因序列分析,确定为美洲型PRRSV,命名为TM株。Nsp2基因序列分析发现,与美洲型标准毒株VR-2332相比,该分离株在481位和532位～560位共有30个氨基酸缺失;此外,与近年来国内分离的PRRSV变异株相比,在22位～42位有21个氨基酸的独有缺失。回归试验表明,该分离株可引起仔猪表现明显的临床症状和病毒血症,证实我国已经出现新缺失高致病性PRRSV毒株。

不同猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株在Marc-145细胞的生长特性研究

本试验对PRRSV-CG、YN9、TP、TP-A及SHB株在Marc-145细胞上进行了部分体外生长特性研究。病毒生长曲线分析发现TP-A毒株产生病变速度快且病毒滴度高,其次为YN9、TP、CG和SHB;病毒蚀斑形态学分析发现TP-A和YN9较其余毒株形成的蚀斑大且比较均一,为大蚀斑。综合可见不同的PRRSV分离株体外生长特性具有较大的差异,为病毒的分子生物学研究奠定了基础。

1株鸭3型腺病毒的分离鉴定及fiber基因序列分析

本研究通过病毒分离、PCR和基因测序等方法,从广东某鸭场疑似“白肝病”发病鸭的肝组织样品中分离了1株鸭3型腺病毒,命名为GD2019株。序列分析结果显示,分离株fiber基因包含fiber-1和fiber-2两个片段,长度分别为1380、1443 bp。鸭3型腺病毒fiber基因非常保守,GD2019株fiber-1和fiber-2基因与已报道的鸭3型腺病毒同源性均为100%,而与其他禽腺病毒同源性则较低,亲缘关系较远。

鸭瘟病毒UL51基因在感染宿主细胞中的定位和转录特征

对鸭瘟病毒(DPV)UL51基因在感染宿主细胞内的定位和转录时相进行分析,为进一步研究该基因的特性和功能提供有用的试验数据和材料。构建pET32a-UL51原核表达载体,将其转化至E.coliBL21(DE3)中进行IPTG诱导表达后,用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱层析法纯化该表达产物。以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子,制备兔抗UL51多克隆抗血清,通过间接免疫荧光和RT-PCR法检测该基因在DPV感染的鸭胚成纤维细胞(DEF)内的定位和转录情况。间接免疫荧光结果显示,最早可在感染后8h的胞浆中检测到特异性荧光点,24～36h有大量绿色荧光团块聚集于近核区域,之后随着细胞病变的增强,胞浆中的绿色荧光开始减弱,且在感染晚期的胞核中也出现了少量弥散的绿色荧光。RT-PCR结果显示,DPVU L51基因从感染后4h开始转录,其后转录量不断增大,从6～48h一直保持在较高水平,之后又降低。DPVU L51蛋白主要定位于感染的宿主细胞的胞浆中特别是近核区域,与其在α-疱疹病毒中的同源物的定位结果一致;并且与其他几种α-疱疹病毒的转录情况对比后,可认为该基因是一个晚期(γ类)基因。