板蓝根抗甲1型流感病毒活性物质的初筛研究

【目的】观察不同提取工艺及方法制备的板蓝根样品的抗流感病毒作用,以筛选板蓝根中抗流感病毒的有效成分及活性物质。【方法】于狗肾细胞(MDCK)上接种人甲1型流感病毒PR8株(A/PR/8/34,H1N1),采用细胞病变抑制法(CPE法),在不同试验策略下(保护、治疗模式)评价不同提取工艺及方法制备的板蓝根样品的体外抗流感病毒作用。【结果】在无毒浓度下,从不同工艺制备的板蓝根样品中筛选到1份有抗流感病毒活性的成分,该成分为醇溶液通过大孔树脂用纯水洗脱的洗脱液(S-03),其体外抗病毒选择指数为4.8。【结论】发现板蓝根样品中抗流感病毒作用较为明确的成分。

银翘散体内抑制甲1型流感病毒FM1株复制作用的实验研究

目的:观察中药银翘散体内抑制甲1型流感病毒FM1株复制的作用。方法:以甲1型流感病毒FM1鼠肺适应株滴鼻感染BALB/c小鼠,并用病毒唑及高、中、低剂量银翘散干预相应组别小鼠,观察生存状态及检测肺指数,以苏木素-伊红染色(HE染色)法观察病理改变;将鼠肺悬液以空斑减少试验定量检测感染性病毒滴度,蛋白免疫印迹技术检测核蛋白(nucleoprotein,NP)表达。结果:银翘散可以减轻全身症状,降低肺指数;减少鼠肺病变范围及肺泡腔渗出物;降低鼠肺病毒滴度及鼠肺流感病毒NP表达量。结论:银翘散有体内抑制甲1型流感病毒FM1株复制的作用。

黄芩苷对甲型流感病毒PR8株的体外抑制作用研究

目的:研究不同来源黄芩苷对甲型流感病毒PR8株的体外抑制作用。方法:制备流感病毒空斑模型,通过预防保护(病毒吸附前给药)和治疗(病毒吸附后给药)2种模式观察黄芩苷对流感病毒不同阶段的抑制作用并结合神经氨酸酶抑制试验寻找其可能的作用位点。结果:2种受试黄芩苷样品A和样品B对MDCK细胞毒性(半数有毒浓度,TC50)分别为0.099 mg/mL和0.8 mg/mL;黄芩苷A在预防保护和治疗模式中均未发现明显的病毒抑制作用(IC50>0.3mg/mL);黄芩苷B在预防保护和治疗模式中的半数有效抑制浓度(IC50)分别为0.08和0.045mg/mL(选择指数SI为10和17.7),并对神经氨酸酶(NA)活性显示一定的抑制作用(IC50=51.7μg/mL)。结论:市售商品化黄芩苷B有确定的体外抑制流感病毒PR8株的作用。

银翘散对感染甲1型流感病毒金刚烷胺耐药株小鼠的抗病毒研究

以经过耐药表型和基因型鉴定的甲1型流感病毒金刚烷胺耐药株感染BALB/c小鼠,观察其生存状态并测定肺指数,以苏木素—伊红染色(HE染色)法观察肺组织病理改变;将鼠肺悬液以空斑试验定量检测感染性病毒滴度。研究结果表明,银翘散可以减轻甲1型流感耐药株感染小鼠引起的全身症状,降低肺指数;减少鼠肺病变范围及肺泡渗出物;降低鼠肺病毒滴度。说明银翘散有体内抑制甲1型流感病毒金刚烷胺耐药株复制的作用。

白藜芦醇对常见肠道病毒抑制作用的实验研究

目的:观察白藜芦醇体外对多种肠道病毒的抑制药效,为进一步探讨其抗肠道病毒谱提供依据。方法:采用细胞病变抑制法(Cytopathic effect inhibition Assay,CPE)和四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,通过计算病毒抑制率、药物半数有效浓度(IC_(50))及选择指数(selection index,SI),研究白藜芦醇体外对抗多种肠道病毒的作用效果。结果:肠道病毒属(EV)11、EV71、EV84、柯萨奇病毒(COX)B3和COX A10等5种病毒的TCID50分别为:2.13×10^(-4),1×10^(-4),2.13×10^(-6),1×10^(-5)及4.67×10^(-4)。白藜芦醇在Vero E6细胞的半数毒性浓度TC_(50)为50μg/mL。白藜芦醇最大无毒浓度为25μg/mL,以此为抗病毒活性检测的起始浓度。在最大无毒浓度下,白藜芦醇与阳性对照药对5种肠道病毒均有抑制作用。除EV84病毒外,白藜芦醇的抑制率均高于阳性药物利巴韦林。结论:白藜芦醇体外具有抗多种肠道病毒作用,对于病毒性肠道传染病防治具有一定应用前景。

白藜芦醇抗柯萨奇病毒作用机理研究

在非洲绿猴肾细胞(Vero E6)上接种柯萨奇B2病毒,采用细胞病变抑制法(Cytopathic effect inhibition Assay)和四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,在预防、治疗和直接作用3种试验模式下探讨白藜芦醇体外对柯萨奇病毒的抑制作用。白藜芦醇体外抗病毒药效显示:(1)预防模式对柯萨奇病毒无抑制作用;(2)治疗和直接作用模式对柯萨奇病毒均有一定程度的抑制作用,且治疗模式(抑制率为71.5%)效果优于直接作用(抑制率为41.5%)。说明白藜芦醇对柯萨奇病毒具有体外抑制作用,其可能通过多个途径抑制病毒在宿主细胞内的复制。

1型登革病毒抗原表位嵌合人3型腺病毒六邻体重组病毒的构建及免疫学鉴定

目的构建六邻体嵌入1型登革病毒（DENVI）抗坂表位的人3型重组腺病毒，鉴定其抗原性。方法以人3型腺病毒骨架质粒pBRAd△E3GFP为模板，overlap PCR在六邻体高变区HVR1插入DENV1的抗原表位，突变的六邻体片段克隆到穿梭载体，酶切后与线性化的3型腺病毒骨架质粒pBRAd△E3GFP在大肠杆菌BJ5183同源重组，获得阳性重组腺病毒质粒pBRAd△E3GFP-DENV1。线性化后转染AD293细胞拯救重组腺病毒rAd△E3GFP-DENV1并大量培养。纯化后腺病毒免疫BALB／c小鼠，通过ELISA和Western blot检测小鼠的体液免疫应答。结果在人3型腺病毒六邻体成功插入DENV1抗坂表位并包装出重组腺病毒，ELISA和Westernblot结果显示小鼠免疫后能产生血清识别DENV1。结论成功构建六邻体HVR1嵌入DENV1抗原表位的重组腺病毒，为多价登革病毒疫苗的研究奠定了基础。

板蓝根水提物S-03体外抑制甲、乙型流感病毒感染的实验研究

以水提法分离制备板蓝根水提物S-03分析其基本化学成分,并在狗肾细胞（MDCK）上分别接种人甲1、3型和乙型流感病毒标准株、临床分离株以及禽流感病毒,采用空斑减少和免疫荧光及血凝抑制实验方法,在预防、治疗和直接作用三种试验模式下探讨S-03体外对流感病毒的抑制作用。研究结果表明S-03的主要化学成分为糖类,多糖所占总重的比例最高。S-03体外抗病毒药效显示：①预防模式：对各型流感病毒均无抑制作用;②治疗和直接作用模式：对不同亚型流感病毒均有一定程度的抑制作用,且直接作用（SI=2.5~16）效果优于治疗模式（SI=2.2~5.8）;③血凝抑制试验：对不同亚型的人流感病毒血凝素有不同程度抑制作用（最低抑制浓度为3.12~25 mg/mL）,并且对禽流感病毒（H6N2、H7N3、H9N2）的血凝素也有一定的抑制作用（最低抑制浓度25~50 mg/mL）,其作用机制可能为抑制流感病毒表面的血凝素（HA）,从而阻止病毒感染。

广州市成人流感样疾病882例病原学及临床特征分析

目的 探讨引起广州地区成人流感样疾病（influenza like illness,ILI）的呼吸道病毒病原学分布及其临床特征.方法 2009年1-9月份采集882例成人ILI患者的鼻和（或）咽拭子,应用小瓶离心法进行病毒分离与鉴定,并对患者的临床特征进行分析.结果 （1）病原学分布：882份鼻和（或）咽拭子标本中,病毒培养阳性385份（43.7%）,共检测出9种病毒,以季节性甲型流感病毒为主,共259例（67.3%）,其余分别为乙型流感病毒107例（27.8%）;人副流感病毒（HPIV）1～3型5例（1.3%）;腺病毒、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）及肠道病毒各2例（0.5%）;混合感染8例（2.1%）,其中季节性甲型流感和乙型流感病毒混合感染6例,乙型流感病毒与HPIV-3混合感染1例,腺病毒与呼吸道合胞病毒（RSV）混合感染1例.2009年3-5月份以乙型流感病毒为优势毒株,6-8月份则以季节性甲型流感病毒为主;（2）临床特征：ILI患者以18～30岁人群为主（49.7%）,中度发热、咽喉痛及咳嗽为主要临床症状,上呼吸道感染和肺炎的比例为88.4%（727/882）和10.7%（95/882）.季节性甲型流感和乙型流感的临床症状相似,流感病毒检测阳性组的白细胞和淋巴细胞平均数均较病毒阴性组低.腺病毒、HPIV及RSV感染者年龄较低,肠道病毒与疱疹病毒感染者未出现皮疹.结论 （1）引起2009年广州地区成人ILI的病原以季节性甲型流感和乙型流感病毒为优势病毒,其他呼吸道病毒散发,病毒病原体多样化特征不明显,呈季节性流行;（2）不同病毒感染的成人ILI患者发热程度不同,伴有明显的全身和上呼吸道症状,肺炎少见.

2009年广州地区季节性甲型流感病毒对烷胺类药物耐药性分析

目的 分析2009年1-10月份广州地区季节性甲型流感病毒对烷胺类药物的耐药情况,为临床预防和治疗季节性甲型流感提供参考依据.方法 选取2009年1-10月份广州地区6家医院分离的季节性甲型流感病毒株311株,其中H1亚型159株,H3亚型152株.对病毒的毒株基质蛋白（MP）基因进行序列测定,利用数据库和软件进行生物信息分析,并测定软件随机抽取的临床分离的H1和H3病毒株（各10株）对金刚烷胺的药物敏感度,分析广州地区2009年1-10月份季节性甲型流感病毒的耐药性和基因重组情况.结果 159株H1亚型流感病毒中148株对金刚烷胺耐药（93.1%） 152株H3型流感病毒均对金刚烷胺耐药（100%） 除1株H1亚型流感病毒发生V27A/S31N双重位点突变外,其余均为S31N单位点突变 159株H1亚型流感病毒中MP基因B型（人类）97株,F型（欧洲/澳洲鸟类）62株 152株H3亚型病毒的MP基因均为B型.结论 广州地区季节性甲型流感病毒对烷胺类药物的耐药比例高,且H1亚型流感病毒与欧洲/澳洲鸟类流感病毒可能存在MP基因交换.

人3型腺病毒衣壳六邻体嵌合乙肝病毒preS1双抗原表位重组体的构建及其抗原性的初步鉴定

目的：通过构建在六邻体中嵌合表达乙肝病毒表面抗原preS1上两个中和抗原表位的人3型重组腺病毒，鉴定应用此策略所展示表位的抗原性。方法利用overlap PCR技术扩增出在HVR1和HVR2中分别引入乙肝病毒表面抗原中和表位KR359和KR127的嵌合六邻体基因，酶切后连接入穿梭质粒pBR322-L/R，然后与骨架质粒pBRAdΔE3GFP共转化至BJ5183中重组，得到阳性克隆pBRAdΔE3GFP-preS1。将其线性化后转染293细胞拯救病毒，再大量扩增并纯化。同时应用表达载体pGEX-4T3表达融合蛋白GST-KR359KR127，将重组病毒和GST融合蛋白分别免疫BALB/c小鼠获得多抗血清。 ELISA、Western blot实验鉴定嵌合表位的抗原特性。结果人3型腺病毒载体成功的在衣壳六邻体表面展示了乙肝病毒表面抗原中和表位KR359和KR127，并且诱导产生的多抗血清能识别GST融合表达抗原以及天然的乙肝病毒表面抗原。结论衣壳融合策略置换高变区来展示外源中和表位的方法可行，并且可以通过同时置换多个高变区来达到加强免疫效果或者多价抗原免疫保护的作用，为人3型腺病毒六邻体嵌合载体系统在疫苗研究中的应用奠定基础，同时也为新型乙肝疫苗的研制奠定基础。

金刚烷胺与利巴韦林对不同甲型流感病毒株的体外作用敏感性比较

目的评价金刚烷胺和利巴韦林对不同甲型流感病毒株的体外抑制作用,为临床选择抗流感病毒药物提供实验依据。方法分别接种甲型流感病毒标准实验株[H1H1(A/PR/8/34、A/FM1/47),H3N2(A/Aichi/2/1968)]和临床分离株[H1N1(A/Guangzhou/GIRD02/2009、A/Guangzhou/GIRD166/2009),H3N2(A/Guangzhou/GIRD18/2009、A/Guangzhou/GIRD26/2009)],于狗肾细胞(MDCK),采用空斑试验观察金刚烷胺和利巴韦林对甲1和甲3型流感病毒不同实验株和分离株的敏感性。对测试毒株的MP基因进行序列测定和分析,了解金刚烷胺的药物敏感性。结果金刚烷胺在MDCK细胞的半数毒性浓度(TC50)为335μg/ml,对部分甲型流感病毒标准实验株[A/FM1/47(H1N1)、A/Aichi/2/1968(H3N2)]及临床分离株[A/Guangzhou/GIRD02/2009(H1N1)]有抑制作用(半数有效浓度IC50分别为14.9、20.1、16.8μg/ml)。利巴韦林的TC50为2.05mg/ml,对测试的所有毒株均有抑制作用(IC50为6.8～37μg/ml)。金刚烷胺耐药毒株均为单位点突变(第31位的丝氨酸S置换为天冬酰胺N,S31N)。结论甲型流感病毒对金刚烷胺较易出现耐药,而利巴韦林体外对金刚烷胺敏感株和耐药株均有显著的抑制作用,临床抗流感病毒治疗时可考虑应用。

一种病毒运送培养基的改良及其评价

目前我国临床实验室常用的病毒运送培养基多以商业化产品为主，但其效果未见相应的实验数据。本研究利用流感病毒PR8株、呼吸道合胞病毒Long株作为试验用病毒的代表，根据临床实际应用情况对病毒运送培养基的最适条件进行筛选和评价。

冷氧等离子体杀灭甲型H1N1流感病毒的实验研究

目的在自行设计的等离子体反应装置中,模拟冷氧等离子体对甲型H1N1流感病毒气溶胶的杀灭作用。方法以甲型H1N1流感病毒PR8株和2009年季节性甲型H1N1流感病毒临床分离株作为指示病毒株,将流感病毒悬液雾化成气溶胶状态(约3.5μm),通过装置有冷氧等离子发生器和普通紫外灯管(8W)的自制管道,分别作用30min,在管道上、下方的出口收集病毒气溶胶于基础培养基(MEM)培养液中;以空斑形成法检测收集的流感病毒滴度。结果无任何干预条件下,流感病毒悬液雾化经过管道后,PR8株平均存活率为23.0%,病毒滴度下降0.64logPFU,临床分离株平均存活率为35.7%,病毒滴度下降0.44logPFU;PR8株气溶胶颗粒经冷氧等离子和普通紫外灯作用后,平均病毒滴度分别下降2.19、5.83logPFU,相对杀灭率为99.35%、100.00%;临床分离株气溶胶颗粒经冷氧等离子和普通紫外灯作用后,平均病毒滴度分别下降2.15、1.95logPFU,相对杀灭率为99.3%、98.9%。结论冷氧等离子对于受测的甲型H1N1流感病毒气溶胶,均显示了较好的杀灭作用,与普通紫外灯效果基本类似。

广州地区2009年乙型流感病毒血凝素基因特征分析

根据抗原性和基因特异性的差异，乙型流感病毒可分为B／Victoria／2／87系（Victoria系）和B／Yamagata／16／88系（Yamagata系）。血凝素（HA）基因与该病毒的进化趋势相关，HA的抗原变异主要发生在HA1区域，