BVDV中E^(rns)、N^(pro)蛋白真核表达质粒的构建

目的:试验旨在构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结构蛋白(糖基化囊膜蛋白E^(rns))和非结构蛋白(N^(pro))重组表达载体,利用哺乳动物真核表达系统对E^(rns)、N^(pro)进行表达.方法:参考GenBank中公布的BVDV参考株核苷酸序列分别设计引物N^(pro)-F/R和E^(rns)-F/R,用BVDV病毒的cDNA进行PCR扩增,将回收纯化的N^(pro)和E^(rns)目的基因和真核表达载体pCMV-Myc进行双酶切.利用琼脂糖凝胶电泳进行回收纯化,将回收纯化产物采用T4 DNA连接酶进行连接并转化至BL-21感受态细胞中,构建真核表达质粒,将重组质粒命名为pCMV-Myc-N^(pro)和pCMV-Myc-E^(rns).双酶切及测序鉴定正确后转染HEK-293细胞,采用PCR及Western blotting检测N^(pro)和E^(rns)在细胞内的表达.结果:pCMV-Myc-N^(pro)和pCMV-Myc-E^(rns)真核表达质粒构建成功,N^(pro)和E^(rns)在HEK293细胞中成功表达.结论:N^(pro)、E^(rns)蛋白的成功表达可为探究蛋白质生物学功能、研究病毒感染机制及研制亚单位疫苗提供理论参考.

张掖市非洲猪瘟防控现状分析及建议

我国发生第一例非洲猪瘟疫情以来,张掖市严格落实各项防控措施,动物防检疫工作有序推进,生猪调运监管不断强化,病死畜禽无害化处理机制逐步形成,生猪及其产品质量安全得到源头治理,非洲猪瘟重大动物疫病防控工作取得阶段性成果,未发生非洲猪瘟疫情。就目前疫情形势来看非洲猪瘟疫病防控工作决不能松懈。

牛轮状病毒动物模型建立及疫苗研制进展

牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)是导致犊牛病毒性腹泻的主要病原体之一,具有基因型复杂、传播广泛、病死率高、可种间传播等特性.目前尚无特效治疗药物.文章对BRV生物学特性、小鼠模型建立和疫苗研究进展作一综述.

牛轮状病毒VP4基因RT-qPCR检测方法的建立

旨在建立快速特异的牛轮状病毒(BRV)实时荧光定量PCR检测方法,用于病原初步筛查。首先以BRV VP4作为目的基因,通过查询Genbank设计合成引物,然后将扩增的VP4基因片段克隆至pMD 18-T载体中,构建重组质粒标准品,最后经优化反应条件,建立了最低检测量可达7.21 copies/μl的EvaGreen荧光定量检测方法。经验证,该方法特异性好,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒及牛结核分枝杆菌的检测结果均为阴性;重复性较强,组内重复和组间重复变异系数分别为0.95%~1.12%和1.55%~2.18%。此外,利用该方法检测了21份ELISA阳性样本,测得阳性符合率为90.47%。本研究建立的BVR VP4 RT-qPCR检测方法特异、敏感、可重复,可用于病原的快速检测,为BRV临床诊断提供了一种高效、可靠的检测方法。

碳酸饮料对雌鼠子宫发育及FSHR表达的影响

目的:探讨碳酸饮料对子宫发育、促卵泡激素(FSH)分泌及促卵泡激素受体(FSHR)蛋白表达的影响.方法:将150只雌鼠随机分为5组:可口可乐1组(COC-1)、可口可乐2组(COC-2)、百事可乐1组(PEP-1)、百事可乐2组(PEP-2)和对照组(CG).COC-1和COC-2组分别饮用50%和100%的可口可乐,PEP-1和PEP-2组分别饮用50%和100%的百事可乐,CG组自由饮用自来水.每隔5 d采集子宫和血液样品,Western Blot检测子宫FSHR蛋白表达水平,ELISA检测血清FSH和LH浓度.结果:与CG组相比,第25 d时COC-2和PEP-2组子宫重量显著降低,子宫皮质厚度(UWT)减小,子宫FSHR蛋白水平分别降低21.14%和22.80%,COC-1、COC-2和PEP-1组血清FSH含量分别降低27.44%、25.58%和26.86%.雌鼠产仔后较CG、COC-1和PEP-1组,COC-2和PEP-2组新生仔鼠7 d内存活率显著降低,12 d体重显著增加.结论:长期饮用可口可乐和百事可乐会减轻雌鼠子宫重量,影响子宫组织结构,降低子宫FSHR蛋白表达,抑制子宫发育,从而影响了仔鼠的生长发育.

miR-let-7b对卵泡颗粒细胞发育的作用

目的:目前为止,尚不清楚micro-RNA(miR)-let-7b是否通过MAP3K1调节卵泡颗粒细胞(FGCs)凋亡,本研究拟运用PCR和Western blotting方法对此进行实验验证.方法:应用CCK-8测定细胞存活率.设计合成miR-let-7b和MAP3K1 mRNA特异性引物,利用qRT-PCR和Western Blotting分析FGCs中miR-let-7b和MAP3K1 mRNA基因与蛋白的表达水平.结果:随着miR-let-7b模拟物剂量(40、60、80、100、120μM)的增加,FGC的增殖活性逐渐降低,MIM-4组的增殖活性明显低于CG和MIM-1组(P<0.05).miR-let-7b表达水平随着模拟物剂量的增加而逐渐降低,MIM-3和MIM-4组的miR-let-7b水平低于MIM-1(P<0.05或P<0.01).MIM-3和MIM-4组MAP3K1 mRNA和蛋白水平显著低于CG,而且MIM-4组MAP3K1 mRNA和蛋白水平低于MIM-1组(P<0.05).结论:miR-let-7b可明显降低FGC增殖活性.下调FGC中miR-let-7b mRNA表达水平,miR-let-7b处理可剂量依赖性地降低MAP3K1 mRNA和蛋白质表达水平.