人胰腺干细胞诱导胰岛样细胞团及其治疗大鼠糖尿病的效果

目的:观察人胎儿胰腺干细体外诱导分化为胰岛样细胞团及治疗大鼠糖尿病的效果。方法:实验于2005-09/2006-09在西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心完成。人胰腺干细胞为本实验室冻存的1株传至50代的人胎儿胰腺干细胞。采用DMEM/F12培养液,添加B27、1g/L胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、1g/L牛血清白蛋白、10mmol/L烟酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子及10μg/L肝细胞生长因子,诱导胰腺干细胞分化为胰岛样细胞团,应用双硫腙染色、RT-PCR及葡萄糖刺激试验对该胰岛样细胞团进行鉴定。采用完全随机法将30只SD大鼠分为链脲菌素注射组24只,正常对照组6只。空腹12h后,两组大鼠分别腹腔注射70mg/kg体质量的链脲菌素和0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。大鼠分别于注射前、注射后48h、第5天和第8天空腹断尾采血,测定全血血糖浓度。选取连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。采用完全随机法从已成模的糖尿病大鼠中挑出18只分为3组:胰岛移植组9只,进行肾被膜下胰岛样细胞团移植,每只大鼠植入胰岛数(3000±100)个;干细胞移植组3只,肾被膜下移植未进行诱导的胰腺干细胞,细胞数约2×106个;糖尿病对照组6只,肾被膜下移植不含细胞的培养液。3组大鼠均于移植前及移植后48h测定空腹血糖浓度,每周定点测空腹血糖及称体质量1次。结果:18只符合糖尿病模型标准的大鼠与正常对照组6只大鼠均进入结果分析。①成功将人胎儿胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性,RT-PCR检测表达胰岛素,经葡萄糖刺激能释放胰岛素。②共有22只大鼠糖尿病成模,成模率达91.7%。③胰岛移植组大鼠移植后2周内,血糖浓度均有所降低,但仍高于正常血糖浓度范围;移植后第3周血糖浓度迅速上升,之后一直维持高血糖状态。干细胞移植组大鼠移植后血糖一直处于较高水平,移植后第6周血糖开始下降,之后维持于较低水平。糖尿病对照组大鼠血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内。结论:人胎儿胰腺干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞团,该胰岛团能分泌胰岛素,具有一定的抗大鼠糖尿病作用。

斑蝥黄对循环高温环境中怀乡鸡产蛋性能、生殖激素水平、卵泡发育的影响

高温引起的鸡热应激会导致其生殖机能严重下降。本试验以26周龄雌性怀乡鸡为研究对象,探究斑蝥黄对循环高温环境中怀乡鸡产蛋性能、生殖激素水平、卵泡发育的影响。结果表明,与常温对照相比,循环高温环境中怀乡鸡产蛋率及血清中促卵泡素(FSH)、黄体生成素(LH)、孕酮(P_(4))、雌二醇(E_(2))水平降低,等级卵泡、小黄卵泡、大黄卵泡、小白卵泡、大白卵泡数量降低,卵泡膜结构松散、断裂,卵泡颗粒细胞结构受损。常温环境中,饲粮中添加斑蝥黄对怀乡鸡产蛋性能、血清中生殖激素水平有一定提升作用,但对卵泡膜结构无明显影响。循环高温环境中,饲粮中添加斑蝥黄能够显著改善怀乡鸡产蛋性能,提高血清中生殖激素水平,提高各级卵泡数量,缓解高温造成的卵泡膜松散、断裂和卵泡颗粒细胞损伤。综上,斑蝥黄具有较强的抗氧化特性,能够提高怀乡鸡产蛋性能,调节血清中生殖激素水平,降低高温对怀乡鸡造成的伤害,使各级卵泡正常发育并排出。

饲粮添加不同剂量姜黄素对常温和高温环境下罗曼蛋鸡血液免疫指标的影响

该试验旨在探究在常温和高温环境下饲粮中添加不同剂量姜黄素对罗曼蛋鸡血液免疫指标的影响。该试验的群体为360只27周龄的健康罗曼蛋鸡。随机分为12个组,其中常温对照组和高温对照组饲喂基础饲粮,5个常温处理组与5个高温处理组均分别在基础饲粮中添加50、 100、 150、 200、 250 mg/kg姜黄素。常温组饲养环境设置温度为(25±1)℃,高温组饲养环境温度设置为循环高温(32±1)℃8h/d,其余时间为(25±1)℃,所有组湿度维持在65%~80%,试验期为11周。结果显示:在常温环境中,与常温对照组相比,饲粮中添加姜黄素可以显著提高罗曼蛋鸡血清免疫球蛋白G、免疫球蛋白M含量(P<0.05),显著降低血清皮质酮和促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)含量(P<0.05),在姜黄素浓度为200mg/kg时效果较好;高温环境会导致罗曼蛋鸡清IgG、 IgM含量显著下降(P<0.05),皮质酮和IL-1β、 IL-6、 TNF-α含量显著升高(P<0.05);在高温环境中,饲粮中添加150~200mg/kg姜黄素可以显著提高罗曼蛋鸡血清IgG、 IgM含量(P<0.05),显著降低血清CORT和IL-1β、 IL-6、 TNF-α含量(P<0.05)。可见,当饲粮中添加150~200mg/kg姜黄素时,可显著降低罗曼蛋鸡血清中CORT和促炎性细胞因子含量,显著提高血清IgG、 IgM含量,增强机体免疫力。

中草药饲料添加剂对三黄鸡组织器官发育的影响

将 1日龄三黄鸡分为对照组、试验A组和B组 ,每组公母各 2 0只。对照组仅饲喂基础日粮 ;试验A组除供给基础日粮外 ,添加 4 g/kg的中草药饲料添加剂 ;试验B组除供给同样的基础日粮外 ,添加 8g/kg的中草药饲料添加剂。试验结果表明 ,添加 8g/kg水平的中草药饲料添加剂能明显促进热应激下肉鸡肝、肾和胃的生长发育 ;添加 4 g/kg水平的中草药饲料添加剂对热应激下肉鸡组织器官的促生长作用不明显 ;在组织水平上 。

中药添加剂对热应激蛋鸡细胞免疫功能的影响

应用红细胞 C3b受体花环试验及淋巴细胞转化试验 ,研究了中药添加剂对热应激蛋鸡红细胞和淋巴细胞免疫功能的影响 ,结果表明 ,中药添加剂能显著提高红细胞 C3b受体花环促进率 ,显著降低红细胞 C3b受体花环抑制率 ,显著或极显著增加红细胞 C3b受体花环率 ,极显著增加淋巴细胞转化率。中药添加剂可增强热应激蛋鸡的免疫能力。

移植源于人单克隆胰腺干细胞的胰岛治疗大鼠糖尿病

将人单克隆胰腺干细胞（1．0×10^4个／孔）接种在铺有明胶的6孔板内，体外定向诱导其分化为包含大量β细胞的类胰岛。双硫腙染色呈阳性。RTPCR检测，转录表达胰岛素。Sprague-Dawley成年大鼠30只，6只腹腔注射缓冲液作正常对照，24只腹腔注射2％链脲菌素制备糖尿病模型。注射后48h及5、8d，断尾采血，测定全血血糖。随机取3次血糖均〉16．65mmol／L的糖尿病大鼠用于移植试验。DMEM稀释每个阳性孔诱导胰岛细胞至100μL，分别移植在12只糖尿病大鼠左侧肾囊内。6只糖尿病模型对照大鼠左侧肾囊内分别注射100μL DMEM。实验大鼠每10d断尾测全血血糖1次。在为期67d的移植试验中，12只诱导胰岛移植大鼠血糖水平从18．93～25．78mmol／L降至6．32～11．47mmol／L。除2只死于移植感染外，其余存活了54～67d。6只糖尿病对照大鼠血糖水平持续在18．73～25．96mmol／L。1只感染死亡，5只存活了16～42d。6只正常对照大鼠血糖基本保持在3．56～5．83mmol／L，死亡率为0。结果表明，人单克隆胰腺干细胞体外定向诱导能分化为包含大量β细胞的功能性胰岛，移植这些诱导胰岛能降低糖尿病大鼠血糖水平，延长其寿命。

中药添加剂对热应激蛋鸡内分泌机能的影响

用放射免疫分析法研究了中药添加剂对热应激蛋鸡内分泌机能的影响 ,结果表明 ,中药添加剂均能不同程度地协调热应激蛋鸡内分泌机能。其中 ,中药添加剂 B使血浆 T3 含量显著升高 ( P<0 .0 5) ,甲状腺重量增加 ;血浆皮质醇含量极显著降低 ( P<0 .0 1 ) ,肾上腺重量显著减轻 ;血浆 LH、E2 含量显著或极显著升高 。

单克隆人胰腺干细胞分离培养体系的建立

本研究探讨了建立单克隆人胰腺干细胞分离培养体系及单克隆人胰腺干细胞系,对一些影响干细胞增殖的因素进行了分析。无菌取人流产胎儿胰腺组织。切碎至1 mm^3,0.1%Ⅳ型胶原酶消化。低糖DMEM、10%FBS、3.7g/L NaHCO_3、0.08 g/L青霉素及0.1 g/L链霉素培养液贴壁培养细胞。2.5 g/L胰蛋白酶+0.4g/L EDTA消化传代。克隆环筛选单克隆干细胞,培养液中添加10 ng/mL EGF,扩增单克隆干细胞。采用核型分析法检测干细胞染色体,MTT法测定干细胞生长曲线。胶原酶消化胰腺组织.获得单个细胞和细胞团。贴壁培养,原代上皮样胰腺干细胞克隆性生长。胰蛋白酶消化传代,上皮样胰腺干细胞逐渐被纯化。克隆环筛选,获得单克隆人胰腺干细胞。扩增培养。1例来源于4月龄男性流产胎儿胰腺组织干细胞建系,传50代。染色体核型分析,该干细胞系为正常的二倍体细胞。细胞生长曲线显示培养1-4 d,干细胞生长缓慢,5-6 d,进入倍增期。培养液中添加15%FBS,干细胞增殖较快,再添加15 ng/mL EGF或10 ng/mL IGF-Ⅱ,干细胞增殖更快。研究结果表明应用本实验建立的细胞分离培养体系获得了单克隆人胰腺干细胞系。

单克隆人胰腺干细胞的形态和蛋白表达特征

目的研究1例单克隆人胰腺干细胞系的细胞形态和表达特性。方法10例4～5月龄流产胎儿胰腺组织,胶原酶消化。原代细胞DMEM培养,胰蛋白酶消化传代。在传代中逐渐纯化胰腺干细胞。克隆环筛选单克隆人胰腺干细胞,扩增培养。活力较好的细胞液氮冷冻保存。采用HE和Giemsa染色,观察单克隆人胰腺干细胞的形态特征;通过透射电镜分析其超微结构。用免疫组织化学反应和RT-PCR方法,检测其蛋白水平和mRNA水平的表达特征。结果1例来源于4月龄男性胎儿的单克隆人胰腺干细胞建系,传50代。液氮保存细胞1×109个以上。单克隆人胰腺干细胞完全贴璧时呈多角形上皮样,单核,圆形或椭圆形,单、双或多核仁。细胞核质比大,线粒体、内质网等细胞器均不发达,胞质内无分泌颗粒,属于发育早期的胰腺上皮样细胞。共表达胰肠同源域因子1（pdx1）、胰高血糖素、巢蛋白及角蛋白19（CK19）,不表达胰岛素、周期蛋白34（CD34）、CD44及CD45。转录表达pdx1、胰高血糖素及巢蛋白的mRNA,不转录表达胰岛素。结论首次证实1例共表达pdx1、胰高血糖素、巢蛋白及CK19蛋白的单克隆人胰腺干细胞系。

中药添加剂降低蛋鸡热应激的生理机制研究

将尼克红蛋鸡饲养在温度为30℃以上人工气候室中,研究了中药添加剂对慢性热应激蛋鸡生产性能和生理机能的影响。结果表明,在整个试验期,中药添加剂可以缓解热应激对蛋鸡的不良影响,主要表现在,添加中草药添加剂可以提高高温环境中蛋鸡产蛋量,增加蛋重,减少死亡率。进一步研究表明,中药添加剂提高高温环境中蛋鸡生产力的生理机制是:(1)提高了甲状腺分泌功能,使血浆T3含量显著升高(P<0.05);(2)减少了应激引起的肾上腺过度分泌,降低了血浆皮质醇含量;(3)提高了卵巢的功能,使血浆E2含量显著升高(P<0.05)。(4)提高了蛋鸡的免疫力,血液红细胞C3b受体花环率和淋巴细胞转换率增加;(5)改善了蛋鸡营养代谢状况,提高了血液红细胞数,血红蛋白含量和血细胞压积,增加了血液Ca2+,P3+和K+含量。

利用添加剂抗鸡热应激的研究进展

热应激对鸡的危害极为严重。随着对热应激产生机理的不断揭示 ,利用各类添加剂抗鸡热应激的研究进展迅速。本文系统介绍了镇静剂、电解质、维生素、中草药等添加剂抗鸡热应激的理论基础及其在实践中的应用。

中药-甜菜碱复方对高温环境中三黄鸡组织器官生长发育的影响

本试验目的是探讨中药甜菜碱复方对处于高温环境中三黄鸡消化系统和免疫系统部分组织器官生长发育的影响。选择15日龄三黄鸡288只,随机分成8组。高温对照组仅喂基础日粮,中药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别在基础日粮中添加0.4%、0.8%、1.2%的中药,中药甜菜碱Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组分别在基础日粮中添加0.4%中药＋0.2%甜菜碱、0.8%中药＋0.2%甜菜碱、1.2%中药＋0.2%甜菜碱,甜菜碱组在基础日粮中仅添加0.2%甜菜碱。在42日龄、70日龄和98日龄时,每组随机选取4只（2公、2母）,剖解,称量其消化系统和免疫系统部分组织器官重量,并固定,制片,显微镜下观察组织细胞变化。结果表明,与高温对照组相比,添加中药甜菜碱复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组三黄鸡的肌胃、胰腺和肾脏的重量在3个日龄段均显著（P〈0.05）增加,胸腺、脾脏和法氏囊重量显著（P〈0.05）或极显著（P〈0.01）增加;添加中药Ⅱ组和甜菜碱组仅胸腺、脾脏和法氏囊的重量显著增加（P〈0.05）。71-98日龄段,中药甜菜碱复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,甜菜碱组,中药Ⅱ、Ⅲ组肝脏重量显著（P〈0.05）或极显著（P〈0.01）增加。中药、甜菜碱及复合添加剂对15-42日龄腺胃重量和15-70日龄肝脏重量的影响则不明显。组织学观察,高温对照组三黄鸡肝脏、胸腺、脾脏、法氏囊等器官造成不同程度的病理变化,而0.8%中药-0.2%甜菜碱复方组三黄鸡相应的组织器官则未见有明显的病理变化。这表明高温环境对三黄鸡消化系统和免疫系统某些组织器官产生了一定的损伤,添加中药甜菜碱复方可缓解其损伤,促进组织器官的生长发育。其中,以添加0.8%中药-0.2%甜菜碱复方抗高温应激的效果最好。

中药-甜菜碱复方对高温环境下三黄鸡营养代谢的影响

本试验通过研究中药、中药-甜菜碱及甜菜碱对高温环境下三黄鸡营养代谢的影响，筛选出其最佳添加剂量，为进一步开发抗高温应激中药饲料添加剂提供参考。选用288只三黄鸡，公、母各半。育雏2周后，随机分为8组，在日粮中添加中药、中药-甜菜碱或甜菜碱，分别测定33-35日龄、56-58日龄及88-90日龄鸡的钙、磷代谢率，蛋白质、能量代谢率，以及在代谢试验期间的采食量、体增重。结果显示，与高温对照组相比，（1）在33-35日龄段，添加中药、中药一甜菜碱及甜菜碱均能显著提高公、母鸡的钙、磷、蛋白质代谢率和采食量、体增重；（2）在56-58日龄段，添加中药组、中药-甜菜碱组及甜菜碱组均能显著提高公、母鸡的钙、磷、蛋白质代谢率和在代谢试验期间的采食量、体增重以及公鸡的能量利用率；（3）在88～90日龄段，中药、中药-甜菜碱和甜菜碱均能显著提高高温环境中公、母鸡的钙、磷、蛋白质代谢率和采食量，公鸡的能量利用率和体增重。中药-甜菜碱复方抗三黄鸡热应激的最佳添加量为0．8％中药＋0．2％甜菜碱。

中药添加剂对高温环境鸡耐热力的影响

将 2 0 0只尼克红成年蛋鸡饲养在温度为 30℃以上人工气候室中 ,研究了中药添加剂对热应激蛋鸡内分泌机能、免疫机能和血液生化指标的影响。结果表明 ,在日粮中添加中药添加剂 ,可显著提高高温环境中蛋鸡耐热力 ,主要表现是 :(1 )提高了甲状腺分泌功能 ,使血浆 T3含量显著升高 (P<0 .0 5 ) ;(2 )减少了应激引起的肾上腺过度分泌 ,降低了血浆皮质醇含量 ;(3)提高了卵巢的功能 ,使血浆 E2 含量显著升高 (P<0 .0 5 ) ;(4 )提高了蛋鸡的免疫力 ,血液红细胞 C3b受体花环率和淋巴细胞转化率增加 ;(5 )改善了蛋鸡营养代谢状况 ,提高了血液红细胞数、血红蛋白含量和血细胞压积 ,增加了血液 Ca2 + 、P3+ 和 K+ 含量 ;提高了产蛋量 。

胰腺干细胞生物学特性研究进展

胰腺干细胞是一类来源于胎儿或成年胰腺组织中的成体干细胞。多数研究认为胰腺干细胞体外培养时,贴壁生长,呈多角形上皮样,具有较高的扩增性;表达胰腺发育过程中的一些决定因子Pdx1、HNF3β、Ngn3、Th及Isll等,还共表达胰腺终末细胞释放的激素glucagon、insulin等,甚至共表达来源于其它胚层细胞的表达物CK19、nestin等;具有多分化潜能,其特点是在自然分化过程中,优先分化为胰腺组织细胞,在特定的条件下,也可转分化为其它组织细胞。胰腺干细胞生物学的不断深入研究,为分离、克隆胰腺干细胞及定向诱导其分化为功能性胰岛移植治疗人类糖尿病奠定了基础。

单克隆人胰腺干细胞分化特性的研究

研究1例来源于4月龄男性流产胎儿胰腺组织的单克隆人胰腺干细胞(monoclonal hu- man pancreatic stem cell,mhPSC)系的体内外分化特性。将mhPSCs接种在铺有0.1%明胶的培养皿内,扩增培养3 d后,加高糖DMEM诱导液诱导培养25 d。相差显微镜下,观察细胞生长状况。采用双硫腙染色法、RT-PCR及葡萄糖刺激释放胰岛素和C肽实验.对体外定向诱导mhPSCs分化为功能性胰岛进行检测。将mhPSCs悬液注射在成年雄性裸鼠腹股沟皮下。注射30 d时。取出移植物,采用SP法进行免疫组织化学反应。以检测mhPSCs的体内自然分化潜能。体外扩增培养。mhPSCs贴壁生长,呈多角形上皮样。生长至单层,呈"铺路石"状。体外定向诱导,细胞逐渐由多角形变成圆形,并聚集成类胰岛。诱导培养15 d时。形成的类胰岛中少数细胞分化为β细胞,双硫腙染色阳性。诱导培养25 d时,多数细胞分化为β细胞。双硫腙染色阳性,转录表达胰岛素的mRNA。用不同浓度葡萄糖刺激,诱导胰岛不仅释放胰岛素和C肽。而且其释放量随糖刺激浓度升高显著增加(0.01<P<0.05)。体内分化实验显示,mhPSCs在裸鼠背部形成类畸胎瘤。类畸胎瘤易与裸鼠分离,色白,血管丰富,显著表达pdx1、胰岛素、胰高血糖素、CK、MBP及NF蛋白。该研究结果证实单克隆人胰腺干细胞系体外定向诱导分化为包含大量β细胞的功能性类胰岛,在体内自然分化为胰岛、上皮及神经组织细胞。

甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞生长和增殖的影响

【研究目的】研究了不同剂量甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核和增殖的影响,在细胞水平上揭示甜菜碱对三黄鸡生长影响的机理,为甜菜碱在动物生产中的应用提供依据。【方法】体外分离培养三黄鸡胚胎成纤维细胞,在培养液中添加不同剂量甜菜碱,观察细胞生长及分裂。【结果】①在基础培养液(DMEM+15%NBS)中添加10mM,20mM甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核率无显著影响;添加30mM,40mM,50mM甜菜碱显著提高三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的微核率。②在基础培养液(DMEM+15%NBS)中添加10mM、20mM甜菜碱能促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,以在培养液中添加20mM甜菜碱时三黄鸡原代成纤维细胞增殖速度最快。添加50mM甜菜碱时抑制了三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖。【结论】低剂量甜菜碱可促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,高剂量甜菜碱对细胞分裂构成危害。

诱导胰腺干细胞再生胰岛治疗糖尿病的研究

近年来,随着免疫抑制剂的改进及细胞移植技术的不断成熟,胰岛细胞移植已成为治愈Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的有效治疗方法,而胰岛供体短缺的矛盾亦更为突出．胰腺干细胞是一类存在于胎儿或成年胰腺组织中的成体干细胞．体外分离、克隆胰腺干细胞,并定向诱导其分化为功能性胰岛移植治疗糖尿病,是解决胰岛供体短缺的有效途径．目前,该研究已成为组织细胞工程研究的又一热点．文中综述了这一领域研究的最新进展．