14-3-3蛋白在水稻籽粒灌浆过程中的互作靶蛋白鉴定及其对外源激素的响应

【目的】籽粒灌浆对水稻产量及品质的形成至关重要。14-3-3蛋白是一种信号转导调节因子,在植物生长发育中发挥着重要调控作用。本研究通过分析14-3-3蛋白家族在籽粒灌浆过程中的基因表达模式及其互作靶蛋白,从而揭示其在籽粒灌浆过程中的功能。【方法】利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析水稻14-3-3基因家族在籽粒灌浆过程中的表达变化模式,并从中选取GF14b及GF14e进行后续的蛋白功能分析。利用KEGG数据库对GF14b及GF14e蛋白功能motif位点进行分析;构建GST-GF14b及GST-GF14e表达载体,利用亲和层析技术分别钓取籽粒中与GF14b及GF14e互作的靶蛋白,并借助LC-MS/MS对靶蛋白进行鉴定。采用GST pull-down方法验证靶蛋白与GF14b及GF14e间的蛋白互作关系。利用Kinasephos在线程序对靶蛋白的Ser和Thr磷酸化位点进行预测;采用MapMan 3.6.0软件对靶蛋白的功能及参与的代谢过程进行分析。在籽粒灌浆期(花后15 d),分别喷施25×10-6 mol·L-1 ABA,10×10-6 mol·L-1 IAA,100×10-6 mol·L-1 GA,50×10-6 mol·L-1 ZR和2×10-4 mol·L-1 BR,研究外源激素处理对籽粒灌浆过程中GF14b,GF14e及其互作靶基因表达的影响。【结果】14-3-3家族基因中,除GF14h外,其余7个家族成员在水稻籽粒中均有表达,其中GF14b及GF14e在籽粒灌浆过程中的表达水平较高且变化幅度较大。通过蛋白序列分析发现,GF14b与GF14e间具有3个相同,2个差异的motif功能位点。通过亲和层析试验,在籽粒中共鉴定到59个与GF14b和72个与GF14e互作的靶蛋白,其中有43个靶蛋白与2个成员均有互作,分别有16个和29个靶蛋白与GF14b和GF14e特异结合。随机选取2个靶蛋白进行体外蛋白互作验证,结果表明靶蛋白SUS3与GF14b和GF14e均存在互作关系,而靶蛋白PSA仅与GF14e有相互作用关系,验证了亲和层析结果的准确性。蛋白功能的分析表明,GF14b和GF14e通过与靶蛋白的结合,共同参与了籽粒灌浆过程中蔗糖转化、淀粉合成、糖酵解、TCA循环等碳代谢途径。同时,GF14b及GF14e还具有特异的调控功能,其中GF14b与核酸代谢及物质转运密切相关,而GF14e与C1代谢中的关键蛋白存在互作。此外,大部分靶蛋白均鉴定到具有潜在的Ser和Thr磷酸化位点。外源激素处理下,籽粒中GF14b和GF14e上调表达,而与淀粉合成代谢相关的靶基因(SUS2、AGPS、AGPL、PPDK2、SBE)大部分呈下调表达的趋势。【结论】14-3-3基因家族成员GF14b和GF14e在水稻籽粒灌浆过程中的表达变化幅度较大,且会响应激素浓度的改变,并通过蛋白互作的形式负调控淀粉合成代谢相关基因的表达,从而对水稻籽粒淀粉的合成起到重要的调控作用。

多肽配体R18促进水稻弱势籽粒灌浆的初步研究

14-3-3蛋白在植物生长发育中具有重要的调控作用,其亚型GF14f在水稻弱势籽粒中高表达是其灌浆结实差的一个重要的原因。本研究首先通过分子对接的方式,发现多肽R18与GF14f蛋白具有潜在的结合位点,进而采用体外竞争性实验,发现R18能够竞争性的与GF14f蛋白结合,从而导致GF14f与SuS2、SS和AGPS三个互作靶蛋白间的结合力减弱,与此同时,体外酶活实验表明,外源添加R18能够显著提高淀粉合成酶(StSase)、蔗糖合成酶(SuSase)和ADPG焦磷酸化酶(AGPase)3个酶的活性。免疫共沉淀实验表明,R18在水稻籽粒中除了能和GF14f结合外,还能与GF14b、GF14c、GF14d及GF14e结合,BiFC结果也证实了上述结果。籽粒灌浆期,外源喷施60 mg L^(-1)浓度的R18于弱势籽粒上,StSase、SuSase及AGPase酶活性显著提高,弱势籽粒千粒重及结实率也显著提高。本研究结果表明,多肽配体R18能够与14-3-3互作靶蛋白竞争性结合,减弱14-3-3与靶蛋白间的结合力,进而释放籽粒灌浆过程中蔗糖转化及淀粉合成途径中关键酶的活性,从而有利于弱势籽粒灌浆充实。