非洲猪瘟病毒pO174L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了解析非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pO174L蛋白的功能,根据ASFV HLJ/18毒株基因序列(GenBank登录号:MK333180)设计引物,扩增O174L基因并克隆至pET-28a(+)载体中,构建原核表达载体p ET-28a-O174L,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达后,通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定重组蛋白表达产物的抗原性,用重组蛋白免疫新西兰大白兔制备家兔抗pO174L蛋白的多克隆抗体;利用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价,并通过Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,用PCR扩增的O174L基因片段长564 bp,与预期相符;双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET-28a-O174L构建成功,在原核表达系统成功地表达并获得了可溶性蛋白pO174L,分子质量约为21.5 ku;用纯化的蛋白免疫动物后制备了多克隆抗体,抗体效价达到1∶512000;Western-blot和IFA结果显示制备的抗体能够特异性地识别ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞中表达的天然蛋白pO174L。本研究为深入解析pO174L蛋白的功能及其在ASFV感染和致病过程中的作用奠定了基础。

基于非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的间接ELISA检测方法的建立与应用

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种危害性极强的病毒性疾病,该病的发生和流行对全球养猪业、猪肉食品供应及经济发展造成了巨大影响。ASFV基因组较大、编码蛋白众多,但目前很多病毒蛋白的功能尚不清楚。由于缺乏有效的治疗措施和安全的疫苗,所以ASF的防控及疫区的净化仍然面临巨大挑战,而早期、快速、可靠的实验室诊断仍然是该病防控的重要手段。本研究以ASFV基因Ⅱ型毒株的基因组为模板,扩增A104R、B602L、CP204L (P30)、B646L(P72)和K205R基因,并将其克隆至表达载体pET-30a,构建原核表达质粒,经IPTG诱导后表达5种病毒蛋白,其中p A104R、pK205R为可溶性表达,P30、P72、pB602L为包涵体表达。经Western-blot分析鉴定蛋白的抗原性,五种原核表达的蛋白都能够和ASF阳性血清发生特异性反应,通过比较,筛选出pA104R作为最佳诊断抗原,并初步建立了ASFV抗体检测间接ELISA方法。该方法能够敏感、特异的检测ASFV阳性血清,而与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清均无交叉反应。利用建立的间接ELISA方法与商品化间接ELISA抗体检测试剂盒平行检测田间样本,结果表明,本研究建立的方法与商品化试剂盒之间的符合率达到94.7%(142/150)。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法能够用于ASF血清抗体的检测。

非洲猪瘟病毒pH359L蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为制备抗非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV) pH359L蛋白的多克隆抗体,本研究以GenBank登录的ASFV HLJ/18毒株基因序列设计H359L基因的特异性引物,扩增H359L基因并构建pET-28a-H359L原核表达质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱亲和层析纯化蛋白后,免疫新西兰大白兔制备抗pH359L蛋白的多克隆抗体,通过Western blot和IFA试验对制备的抗体反应性进行测定。结果表明,构建的pET-28a-H359L重组质粒无点突变;重组蛋白pH359L在37℃以0.1 mmol/L的IPTG诱导表达量最高,其相对分子质量约为43.0 kDa,与预期大小一致;蛋白以包涵体形式表达;抗pH359L多克隆抗体效价达到1∶512 000;Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能够特异性识别ASFV感染猪肺泡巨噬细胞表达的天然pH359L蛋白。本研究为揭示ASFV pH359L蛋白的功能及ASFV相关的转录机制奠定基础。

非洲猪瘟病毒pNP419L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了评估原核表达的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pNP419L蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值,将PCR扩增的NP419L基因片段插入载体pET-28a中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,以金属离子层析法纯化蛋白后,免疫新西兰大白兔制备家兔抗pNP419L多克隆抗体。结果显示,用PCR成功地扩增了NP419L基因序列,NP419L基因转入表达载体后被成功表达;纯化后的重组pNP419L蛋白的分子质量为42 ku;用间接ELISA检测家兔源多克隆抗体的效价达到1∶512000,IFA试验及Western-blot检测表明该多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。本研究为pNP419L蛋白生物学功能的研究奠定了基础。