韭菜过氧化物酶的分离纯化及性质

经匀浆、抽提、硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的韭菜过氧化物酶(POD)。该酶比活力达到14031.41U/mg,纯化倍数为102.96,回收率为10.85%。该酶分子质量约为28.4kD,最适温度40℃、最适pH值为4.6。该酶在20～40℃以及pH 4.0～8.0有较好的稳定性,在最适条件下测得其Km值为18.15mmol/L。低浓度草酸、Zn2+、Mg2+等对该酶有较强激活作用;甲醇、乙醇、异丙醇、SDS、抗坏血酸(AsA)以及Mn2+、Fe3+等对该酶有较强的抑制作用。

氯化锰对大鼠血-脑脊液屏障的损伤作用

目的探讨氯化锰对大鼠脑脉络丛组织的毒性损伤作用。方法 大鼠ip给予氯化锰6mg(Mn).kg-1建立不同暴露时长(30d,90d及90d后无处理观察30d)的氯化锰中毒动物模型,各时间点染毒结束后采集血清与脑脊液(CSF)样本,提取侧脑室的脉络丛组织。溴甲酚绿法和ELISA法检测血清白蛋白(SALB)与CSF白蛋白(CALB)水平,并计算CSF白蛋白指数。光镜与透射电镜下检测大鼠脉络丛组织、细胞及亚细胞结构的病理形态学改变。结果氯化锰30d组、氯化锰90d组及氯化锰90d+30d恢复组CSF白蛋白、CSF白蛋白指数均明显高于其相应的对照组(P<0.05),并且氯化锰30d组CSF白蛋白、CSF白蛋白指数低于氯化锰90d组与氯化锰90d+30d恢复组(P<0.05),氯化锰90d组CSF白蛋白、CSF白蛋白指数低于氯化锰90d+30d恢复组,但无统计学意义。光镜和电镜观察发现,氯化锰导致脉络丛上皮细胞形状不规则,微绒毛结构紊乱、缩短;胞浆内出现空泡、核质凝聚,线粒体结构破坏,细胞间连接部分断裂或消失等,随染氯化锰时间的延长有加重的趋势,并且脱离氯化锰接触30d后仍表现为进行性加重。结论氯化锰可以引起脉络丛组织病理形态学改变,具有时效性与不可逆性的特征;CSF白蛋白及CSF白蛋白指数与脉络丛的损伤程度呈正相关,可以作为判断血-脑脊液屏障损伤程度的参考指标。

苯丙(a)蒽的毒性研究进展

苯丙(a)蒽(BaA)是一种四环结构的多环芳烃(PAH)类物质,是化石燃料不完全燃烧的副产物,与其他的PAHs以混合物的形式存在。BaA可通过口腔、鼻腔及皮肤等多种途径暴露于人类,对人的主要危害是致癌性。国际癌症研究机构(IARC)根据其分类标准将BaA归为2B类(对人可能致癌)。目前尚无充足数据支持通过计算剂量外推斜率因子(slope factor)来完成动物致癌系数与人体致癌系数之间的推导。本文对BaA的致癌性等毒性研究进行系统文献检索与综述,以期为今后进行BaA的健康风险评估提供可靠的毒理学数据基础。

韭菜过氧化氢酶的分离纯化及其部分酶学特性

为获得韭菜过氧化氢酶纯品并对其性质进行研究,将新鲜韭菜通过匀浆、抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等步骤,获得了电泳纯的韭菜过氧化氢酶(CAT),纯化倍数为70.36,回收率为18.33%,酶比活力达到22064.57U/mg。其全酶分子质量和亚基分子质量分别为241.76、62.43kD。该酶反应的最适温度为37℃,最适pH值为7.2。该酶在25～40℃以及pH5～9有较好的稳定性,同时在最适条件下测得其Km值为46.93mmol/L。甲醇、乙醇、异丙醇、SDS以及Cu2+、Ag+、Fe2+等金属离子对该酶有较强的抑制作用。

血-脑脊液屏障的结构、功能及其毒理学研究进展

血-脑脊液屏障(BCB)位于脉络丛组织中,将外周血与脑脊液(CSF)分为2个相对独立的循环系,负责二者之间的物质转运。BCB通过分泌CSF及其成分维持脑室的稳态环境,同时通过其屏障作用保护脑组织免受各种内源性与外源性有害因素的损害作用,近年来与其相关的毒理学研究主要涉及到药物毒性、重金属毒性以及一些体外实验的研究领域等。

MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS液质联用分析大鼠脑脉络丛的多肽组

脉络丛(choroid plexus,CP)位于血液与脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)之间,不仅是CSF的重要来源,而且是构成血液-脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,BCB)的组织基础.CP参与脑组织中一些血源性多肽的输送以及自身多肽合成的生理过程,在维持脑微环境动态平衡和调节中枢神经系统的正常功能方面起到非常重要的作用.本研究分别运用MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS液质联用系统分析了成年SD大鼠血液-脑脊液屏障(即脉络丛组织)中的多肽组.共鉴定到163个多肽(P<0.001),这些多肽为69种蛋白质的降解肽段,其中ATP合酶(ATP synthase),细胞色素c(cytochrome c),血红蛋白(hemoglobin),NADH-辅酶Q氧化还原酶(NADH-ubiquinone oxidoreductase),β珠蛋白(beta-globin)这5种蛋白质的肽段数占总肽段数的50%以上,并且部分多肽序列相似度高,类似其前体蛋白的逐步降解片段,而这些前体蛋白质的分子量多数在10kD至20kD之间.上述研究结果为SD大鼠脉络丛组织的生理功能研究及组织多肽组学的研究方法提供了有价值的科学资料.

巨大芽孢杆菌产胞外核糖核酸酶的分离纯化及部分酶学性质研究

巨大芽孢杆菌发酵液经硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到核糖核酸酶电泳纯品,并对其性质进行研究。该酶比活力为54272.27U/mg,回收率为11.37%,纯化倍数为606.67倍。该酶分子质量约为33.3kD,最适温度为52.5℃,最适pH值为8.5,在20～40℃以及pH6.0～7.0范围内稳定性较好。Fe2+、Cu2+、SDS、抗坏血酸和草酸对该酶活性有抑制作用。

鲍曼不动杆菌外膜蛋白A1S1969的克隆表达及免疫保护机制初步研究

目的制备鲍曼不动杆菌(Ab)A1S_1969重组蛋白,利用小鼠全身脓毒血症感染致死模型评价A1S_1969重组蛋白的免疫保护效果,探讨可能的免疫保护机制,为筛选Ab疫苗有效的保护性抗原奠定基础。方法基于反向疫苗学技术筛选出Ab外膜蛋白A1S_1969,利用p GEX-6P-2质粒构建GST融合表达载体,重组表达的A1S_1969蛋白经亲和层析高效纯化后与铝佐剂吸附制备而成重组A1S_1969免疫原;采用Balb/c小鼠全身感染模型评价A1S_1969重组蛋白的免疫保护效果,通过ELISA检测免疫小鼠Ig G抗体滴度和Ig G抗体亚型。制备A1S_1969重组蛋白抗血清进行体外调理吞噬杀菌实验。结果成功克隆、表达并纯化A1S_1969重组蛋白,纯度>90%。动物免疫保护结果显示A1S_1969重组蛋白组小鼠存活率为55.6%,对照组小鼠存活率为20.0%(P<0.05);末次免疫7 d后小鼠体内总Ig G抗体滴度为1∶64 000,以Ig G1亚型为主;体外调理吞噬杀菌实验结果显示A1S_1969特异性血清抗体可以增强中性粒细胞对Ab的杀菌作用,实验组杀菌率可达55%,对照组无杀菌活性。结论 A1S_1969重组蛋白可显著提高全身脓毒血症感染致死模型小鼠的存活率,具有良好的免疫保护效果。

秀丽隐杆线虫在化学品毒性评估中的研究进展

化学品毒性评估的传统经典方法是啮齿类动物毒性实验。随着世界各地新化学品的合成数量增多,传统的毒性检测评估模式和测试速度已经远远不能满足市场和人群的健康需求。模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)因其独特的生物学优势正逐渐地被应用到化学品的毒性评估研究中。本文将从秀丽隐杆线虫的生物学优势、化学品毒性评估时线虫基因型的选择、染毒方式、评估指标、高通量筛选技术等方面进行综述,并简要介绍线虫毒性评估的研究专利。最后,对秀丽隐杆线虫的化学品毒性评估应用前景进行讨论和展望。

磷酸腺苷激活的蛋白激酶参与调节细胞外信号调节激酶1/2活化发挥对血管平滑肌细胞胰岛素样生长因子-1信号的抑制作用

目的进一步证实在猪主动脉平滑肌细胞中磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)刺激引起的细胞增生,以及探讨其可能的机制。方法使用AMPK活化剂二甲双胍增强细胞内AMPK的活化(表现为AMPK第172位苏氨酸磷酸化增高);采用定点突变获得组成性激活型AMPK突变体,设计短发卡RNA (short hairpin,shRNA)序列构建AMPK干扰载体,并分别包装产生组成性激活型AMPK和AMPK敲低慢病毒。分别采用AMPK活化剂二甲双胍处理、组成性激活型AMPK慢病毒感染和AMPK敲低慢病毒感染猪主动脉平滑肌细胞,观察AMPK活性对猪主动脉平滑肌细胞中IGF-1刺激引起的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2)活性(表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化)及其下游细胞增生的影响。结果二甲双胍明显增强AMPK的活性(表现为172位苏氨酸磷酸化增高),并明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化(表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化受到抑制);组成性激活型AMPK表达能明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化以及下游的细胞增生;在AMPK敲低细胞中,IGF-1能引起更强的ERK1/2活化。结论 AMPK能通过抑制ERK1/2活化抑制血管平滑肌细胞IGF-1信号,并能抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌细胞增生。

鸭卵清溶菌酶的分离纯化及性质

通过硫酸铵的分级沉淀、CM-Sepharose阳离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等步骤,从鸭卵清中获得电泳纯的溶菌酶,该酶的比活力达到33687.26U/mg,纯化倍数为109.44,回收率为28.00%。测得该酶分子质量约为14.82kD,对溶壁微球菌的最适反应温度为50℃,最适pH值为7,且在50℃以下及pH5～9有较好的稳定性,同时在最适条件下测得其Km值为0.0864mg/mL。Fe2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对该酶有较强的抑制作用,而Zn2+、Cu2+、Co2+对该酶有一定的激活作用。

条件性基因敲除动物及其在毒理学研究领域的应用进展

动物实验是毒理学研究中的重要手段和核心内容。传统的基因敲除动物在胚胎致死性基因研究方面具有一定局限性。条件性基因敲除动物在克服传统基因敲除动物缺陷的情况下,为更深、更广的毒理学研究提供了重要工具。本文将从条件性基因敲除技术的原理及条件性基因敲除动物在毒理学领域中的应用进展两方面来进行综述。

功能纺织品实验动物安全性及功效性研究

目的观察负离子布料的安全性及动物功效。方法采用局部封闭涂皮实验法(BT法)进行豚鼠变态反应试验。动物与负离子布料接触一定时间后,立即进行小鼠游泳试验10 min,测定运动前后的小鼠血乳酸数值及变化情况,并在进行小鼠负重游泳试验后,测定小鼠红细胞计数、红细胞压积与血红蛋白。结果负离子布料的豚鼠试验未见皮肤变态反应;离子布料可降低运动后休息20 min血乳酸值(P<0.05),降低运动前后血乳酸变化值(P<0.05);并可升高红细胞压积(P<0.05)。结论离子布料对皮肤是安全的;对清除运动后血乳酸的堆积,缓解体力疲劳有一定作用;且可提高机体的携氧能力。

脑脉络丛组织的连接蛋白、转运蛋白及其药理毒理学研究进展

脑脉络丛组织是血-脑脊液屏障的物质基础,也是脑脊液的重要来源。其上皮细胞之间的紧密连接由连接蛋白组成,是维持细胞间机械屏障的结构基础,不仅具有调节细胞间物质流动和维持上皮细胞极性的功能,而且还参与细胞增殖分化和基因转录等过程的信息传递与调控;其上皮细胞膜上分布的各种转运蛋白,不仅在提供营养和激素等脑组织生长发育所必需的物质、清除脑脊液中的一些有害化合物及代谢物方面起关键作用,而且在药物与毒物的运输调控方面也起着至关重要的作用。这些连接蛋白和转运蛋白构成一个复杂的相互关联的网络结构,在维持脑室生理稳态以及保护脑组织免受内源性和外源性有害物质损害方面发挥着非常重要的作用,近年来备受关注。本文就脑脉络丛组织的连接蛋白、转运蛋白及其药理学与毒理学方面的研究进展作一综述。

毒理蛋白质组学研究进展

蛋白质组学技术应用于毒理学研究而发展起来的毒理蛋白质组学包括机制性研究与生物标志物研究两方面的内容。近年来,毒理蛋白质组学发展迅速,在肝毒性、肾毒性、生态毒性、药物毒性、神经毒性等毒理学分支的机制与生物标志物研究中均取得了显著的成绩,并且其实验体系也日趋完善与成熟。

大鼠血清葡萄糖测定分析的影响因素

目的探讨大鼠血清葡萄糖测定分析的影响因素。方法分别用两台生化分析仪、两种方法的试剂或不同保存条件的大鼠血清样品检测葡萄糖水平。结果两台生化分析仪测定大鼠血清葡萄糖的结果差异无统计学意义(P>0.05),相关性良好(相关系数r为0.994);两种方法的试剂测定结果差异显著(P<0.01),但相关性良好(相关系数r为0.999);血清即刻测定与4℃冷藏保存4 h、24 h测定的结果差异均无统计学意义(P>0.05),相关性良好(相关系数r为0.999);血清即刻测定与-20℃、-80℃冷冻保存1个月的测定结果差异显著(P<0.01),相关性良好(相关系数r为0.999)。结论进行大鼠血清葡萄糖测定相关动物实验时,应注意所使用的检测仪器设备、试剂方法、样品保存条件的一致性,保证样品检测过程分析阶段的质量。

基于微流控芯片平台的秀丽隐杆线虫衰老模型研究进展

秀丽隐杆线虫作为国际公认的模式生物是衰老研究的理想模型,而微流控芯片因为其高通量、微型化、自动化和多功能集成化等独特优势,被越来越多地应用于秀丽隐杆线虫的研究中。本文综述了基于新型微流控芯片平台的秀丽隐杆线虫模型在衰老研究中的进展,并展望了微流控芯片在以秀丽隐杆线虫为模型进行寿命研究中的应用前景。

曲酸对健康影响的危害评估

曲酸(Kojic Acid)作为常见的曲霉属和青霉属真菌的代谢产物,存在于传统酿造和发酵食品中,因其具有防腐、保鲜、抗氧化、抗菌、护色和美白等功效,近年来在食品、化妆品和医药等领域广泛应用。本研究参考粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)关于系统文献检索指南的方法,通过检索数据库以及权威机构网站中与研究相关的文献,获取相关的试验研究及人群流行病学研究等信息,开展曲酸的健康危害评估。

基于单个外周血浆细胞技术筛选MRSA人源性单克隆抗体的实验研究

目的建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)人源性单克隆抗体筛选方法。方法从52份重组MRSA多价亚单位疫苗的Ⅰ期临床研究受试者血液样本中筛选出抗体滴度高的血样,利用流式细胞术分选其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中浆细胞,以mRNA为模板PCR扩增抗体重链、轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR分别将将抗体重链、轻链可变区基因与CMV启动子、人恒定区及多聚A尾连接,构建成单克隆抗体线性表达载体,PEI瞬时转染293T细胞进行抗体表达。结果流式细胞术分选出1 120个浆细胞,筛选出了39个针对MRSA 5种保护性抗原α-溶血素(Hla)、铁离子表面决定蛋白B(Isd B)、金葡菌蛋白A(SpA 5)、肠毒素B(SEB)及锰离子结合蛋白C(Mnt C)的人源性单克隆抗体,ELISA结果显示抗体能与抗原蛋白结合。结论通过单个外周血浆细胞技术,成功筛选出了能够与抗原结合的MRSA人源性单克隆抗体,为研究MRSA治疗性人源性抗体奠定了良好基础。

氯化锰对大鼠动脉血与静脉血主要血液生化指标的影响与比较

目的在非临床毒理学安全性评价的动物试验中,血常规与血清生化指标等常作为一般毒性的反映指征,但国内外各标准指南中对于血样的采集方式却没有统一的要求,有时会影响试验结果的准确性。本研究即以氯化锰为受试物,通过短期内连续大剂量暴露于大鼠后,比较其对动脉血与静脉血的血常规及血清生化等指标的影响。方法48只SD大鼠按体重随机分为6组,分别为动脉采血与静脉采血的对照组、低剂量组(25 mg/kg·bw)及高剂量组(50 mg/kg·bw)。低剂量组与高剂量组通过腹腔注射给予MnCl_(2)·4H2O(对照组相同处理给予生理盐水)7 d后,按预定计划采血后分别检测血常规、血清生化及电解质等。结果氯化锰染毒后,大鼠的体重明显下降且具有剂量依赖性(F=22.904,F=18.897,P<0.01);低剂量组主要引起动脉血MCV、MCH、MONO%、ALT、AST、UREA、CREA的下降与PLT、Cl^(-)的升高(P<0.05),而静脉血则表现为MCV、MCH、ALT、ALB、CREA的下降以及NEUT%、PLT与Na^(+)的升高(P<0.05);高剂量组主要引起动脉血MCV、MCH、MONO%、ALT、AST、UREA、CREA的下降与RBC、HGB、HCT、NEUT%、CHOL、Ca^(2+)、Cl^(-)的升高(P<0.05),而静脉血则表现为MCV、MCH、ALT、ALB、CREA的下降(P<0.05);析因分析提示,氯化锰处理是引起RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、NEUT%、PLT、ALT、AST、GLU、ALB、CREA、CHOL、Ca^(2+)、Na^(+)与Cl^(-)差异的主要因素(P<0.05),而采血方式则是引起RBC、HGB、HCT、AST、GLU、ALB、TP、UREA、CREA、Ca^(2+)、K^(+)、Na^(+)与Cl^(-)差异的主要因素(P<0.05)。结论氯化锰作用下,动脉血与静脉血样中红细胞系、肝功能相关指标、肾功能相关指标以及电解质等的变化均有一定的差别,相比较而言,动脉血能更好地反映氯化锰作用下血液中各临床指标的变化。