大鼠脑缺血急性期脑组织miRNA的表达变化

目的:观察脑缺血急性期大鼠脑组织小RNA(microRNA,miRNA)差异表达。方法:采用双颈总动脉结扎方法制备大鼠脑缺血模型(2VO),脑缺血后30min,将动物断头取皮层脑组织,miRNA表达谱芯片检测miRNA差异表达。结果:与正常组比较,2VO术后60min大鼠皮层脑组织中35个已知miRNA表达上调2倍以上;89个表达下调2倍以上等,其中促进凋亡和影响细胞周期的miRNA,如miR-23、-24、-26、-30、-103、-107等显著上调,与神经干或前体细胞分化有关的let-7、miR-124、-128、-9等也显著上调。结论:miRNA在脑缺血早期表达即有明显差异,可能在大鼠脑缺血早期病理生理变化中发挥作用。

麝香提取物对大鼠皮层神经细胞炎性损伤的保护作用

目的研究麝香提取物(musk extract,ME)对脂多糖(LPS)诱导大鼠大脑皮层神经细胞炎性损伤的保护作用及其可能机制。方法分别培养新生大鼠大脑皮层神经细胞和星形胶质细胞(AC),使用终浓度为10mg/LLPS及ME18mg/L、36mg/L、72mg/L、144mg/L的分别作用于纯化的星形胶质细胞24h,收集条件培养液(ACM)。在神经细胞培养体系中分别加入ACM,采用MTT法及AO/EB染色法测定神经细胞存活率和凋亡率;ELISA法检测ACM中所含炎症因子的变化。结果 ME18mg/L、36mg/L、72mg/L及144mg/L组的神经细胞存活率(%)分别为52.55±3.52、55.77±2.36、64.89±3.45及73.67±1.80,较模型组(43.62±4.51)均显著提高(P<0.05);细胞凋亡率(%)分别为68.11±2.16、44.27±3.68、32.56±2.14及21.89±2.46,与模型组(71.33±3.25)比较,均显著下降(P<0.05,P<0.01);ME组ACM中IL-6呈指数降低,且均呈剂量依赖性。结论麝香提取物对脂多糖所致神经细胞炎性损伤具有显著的保护作用,以144mg/L浓度最佳,其可能通过减少星形胶质细胞分泌IL-6起作用。

盐酸法舒地尔体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的可行性

目的:探讨Rho/Rho激酶(ROCK)抑制剂盐酸法舒地尔体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可行性。方法:全骨髓培养法分离培养大鼠骨髓MSCs,用200μmol/L盐酸法舒地尔诱导分化。倒置显微镜观察诱导不同时间细胞的形态学变化;AO-EB染色法鉴定诱导后细胞存活率;免疫荧光法鉴定诱导后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF200)与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,判断其分化情况。结果:盐酸法舒地尔诱导30、60、90、120及180min后细胞存活率分别为(96.7±2.2)%、(95.3±1.9)%、(93.8±1.8)%、(92.5±2.1)%及(90.1±1.3)%,其中以盐酸法舒地尔诱导120min后,形态变化最为理想。盐酸法舒地尔诱导60、90、120及180min后,NSE阳性表达率分别为(66.5±1.9)%、(88.1±3.2)%、(93.6±1.9)%和(93.5±5.4)%,NF200阳性表达率分别为(70.1±2.9)%、(89.5±1.3)%、(98.1±1.6)%和(98.3±1.9)%,而GFAP阳性表达率均小于5%。结论:盐酸法舒地尔可在体外快速、高效地诱导大鼠MSCs向神经元样细胞分化。

EphA4在海人酸诱导大鼠大脑皮层神经元凋亡中的表达及天麻素的影响

目的:探讨EphA4在海人酸诱导大鼠大脑皮层神经元凋亡过程中的表达变化,及天麻素对EphA4表达的影响。方法:提取新生大鼠大脑皮层神经元体外培养,7d后随机分为对照组、海人酸模型组、海人酸+天麻素干预组;采用倒置相差显微镜观察神经元形态学变化,Hoechst33258荧光染色、AO/EB荧光染色、LDH活性测定检测神经元凋亡和坏死情况,CY3荧光染色检测EphA4表达变化。结果:海人酸模型组较对照组神经元凋亡率显著升高(P<0.01),EphA4表达显著增高(P<0.01);海人酸+天麻素干预组较海人酸模型组神经元凋亡率显著下降,EphA4表达上调显著受抑。结论:海人酸诱导大鼠大脑皮层神经元凋亡过程中EphA4表达增高,天麻素在这一过程中抑制EphA4表达,对神经元具有一定保护作用。

Notch信号在盐酸法舒地尔诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化过程中的作用

目的:探讨Notch信号通路在盐酸法舒地尔诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元分化中的作用。方法:实验分为未转染组、转染组(转染Rn-Notch1-siRNA)、阳性对照组(转染Rn-MAPK-1 Control siRNA)及阴性对照组(转染Negative Control siRNA)等4组。采用盐酸法舒地尔诱导大鼠MSCs分化为神经元。倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况;RT-PCR检测Notch1、Hes1和MAPK1 mRNA的表达变化;免疫细胞化学法检测Notch1、神经元烯醇化酶(NSE)、神经微丝蛋白亚单位(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化;MTT方法检测细胞存活率。结果:①siRNA转染72h,MSCs荧光表达最强,转染率可达91.3%±4.2%;同时,转染组MSCs的Notch1和Hes1 mRNA转录下降(P<0.05);MTT提示转染组细胞存活率也显著减少(P<0.05)。②盐酸法舒地尔可以诱导MSCs向神经元分化,其中以转染组诱导效果最佳,NSE、NF-M的表达率显著的高于其它各组(P<0.05)。结论:盐酸法舒地尔在诱导大鼠MSCs向神经元分化过程中,可能存在Notch信号通路与RhoA/Rho激酶通路信号的协同作用,共同促进MSCs向神经元分化。

盐酸法舒地尔对体外培养大鼠神经干细胞分化的影响

目的观察盐酸法舒地尔对体外培养神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法体外分离培养NSCs,通过不同浓度的盐酸法舒地尔干预后,采用免疫细胞化学及流式细胞技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果分离培养的NSCs具有自我复制、增殖能力,可以表达Nestin;诱导分化后的细胞可以表达NSE和GFAP。免疫细胞化学染色提示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞显著高于对照组(P<0.05),但是不同浓度盐酸法舒地尔之间无统计学差异(P>0.05)。流式细胞仪检测结果显示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞比例明显增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。结论盐酸法舒地尔可以促进NSCs向神经细胞方向分化。

天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用

目的探讨天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用及可能机制。方法提取新生大鼠大脑皮质神经元体外培养,7d后随机分为对照组、海人酸模型组、不同浓度天麻素干预组(12.5、25、50mg/L);采用倒置相差显微镜观察神经元形态学变化,AO/EB荧光染色检测神经元凋亡,LDH活性测定检测胞膜稳定性,CY3荧光染色检测EphA4表达变化。结果与海人酸模型组相比,各天麻素干预组神经元凋亡率、LDH活性显著下降(P<0.01),EphA4表达上调显著受抑(P<0.01),以25mg/L天麻素效果最明显。结论天麻素对海人酸诱导大鼠大脑皮质神经元损伤具有保护作用,以中浓度效果最佳,可能与抗凋亡、稳定细胞膜、抑制细胞活化蛋白EphA4的表达上调等因素相关。

Caveolin-1在大鼠骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的:探讨caveolin-1在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经细胞中的作用。方法:实验分为未转染组、转染组(转染Rn-caveolin-1-siRNA)、阳性对照组(转染Rn-MAPK-1control siRNA)及阴性对照组(转染negative control siRNA)4组。采用β-巯基乙醇诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况;RT-PCR检测caveolin-1和促分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)mRNA的表达变化;免疫细胞化学法检测caveolin-1、神经元烯醇化酶(NSE)、神经微丝亚单位(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化;MTT方法检测细胞存活率。结果:(1)siRNA转染72h,MSCs荧光表达最强,转染率可达(81.5±2.8)%;而且转染组MSCs的caveolin-1mRNA转录下降(P<0.05);MTT提示转染组细胞存活率无显著变化(P>0.05)。(2)β-巯基乙醇可以诱导MSCs向神经细胞分化,其中以转染组诱导效果最佳,NSE、NF-M的表达率显著高于其它各组(P<0.01)。(3)随诱导时间延长,各组caveolin-1表达持续增加,诱导6d达到峰值,与诱导前、诱导6h相比有显著差异(P<0.05)。此外,转染组与其它各组同时点的caveolin-1表达均显著降低(P<0.01)。结论:以caveolin-1为标记蛋白的脂筏在MSCs诱导分化为神经细胞中可能起到重要的调控作用。

天麻素对海人酸干预的大鼠神经干细胞分化的影响

目的:研究天麻素对海人酸干预的神经干细胞分化的影响及其机制。方法:体外分离并培养新生Wistar大鼠神经干细胞,通过免疫组织化学法和免疫荧光法进行鉴定。将神经干细胞分为3组:第1组不加药为空白对照组,第2组加入不同浓度梯度的海人酸,第3组加入天麻素和不同浓度梯度海人酸,计算分化后神经元和胶质细胞比例。结果:培养的细胞具有自我更新和向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的潜能,是神经干细胞。海人酸可以有效诱导神经干细胞向胶质细胞分化,天麻素可在一定程度上阻断海人酸的作用,诱导神经干细胞向神经元分化。结论:天麻素可减少海人酸兴奋性的影响,诱导神经干细胞向神经元分化。

P2Y_1受体介导Aβ_(25-35)所致大鼠星形胶质细胞活化

目的:观察嘌呤受体P2Y1在Aβ25-35所致的大鼠星形胶质细胞活化中所起的作用。方法:体外分离培养大鼠星形胶质细胞,按空白对照、Aβ25-35和P2Y1受体阻断剂MRS2179+Aβ25-35和MRS2179分组干预后,通过免疫细胞化学、免疫荧光法和Western blotting方法观察GFAP和P2Y1表达的变化。结果:各组细胞数量无明显变化。与对照组相比,Aβ25-35组GFAP荧光强度明显增加;MRS2179+Aβ25-35和MRS2179组均降低,两组间无明显差异。Western blotting显示GFAP在各组间表达与免疫荧光法有相似趋势;与对照组相比,P2Y1表达在Aβ25-35组明显增多(P<0.05)和MRS2179+Aβ25-35和MRS2179组无明显变化(P>0.05)。结论:Aβ25-35通过P2Y1受体活化激活星形胶质细胞。

缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织小RNA表达的变化

目的观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)皮层小RNA(microRNA,miRNA)差异表达,以研究其在HIBD的病理生理中的作用。方法建立新生大鼠HIBD模型14 d后,取皮层脑组织,miRNA表达谱芯片检测miRNA差异表达。实时定量PCR检测miR-126、-26a、-674-5p、-21、-25、-290和miR-124、-125b-5p、-9a等9个miRNA。结果 miRNA表达谱芯片结果提示,与对照组比较,HIBD大鼠皮层脑组织中27个已知miRNA表达上调2倍以上;60个表达下调2倍以上。实时定量PCR检测所选择的9个miRNA结果与miRNA芯片结果具有同样趋势。结论 HIBD模型大鼠miRNA表达有明显差异,这些改变可能在HIBD的病理生理中起着重要作用。

DSCAM在大鼠骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的表达变化

目的研究唐氏综合征细胞粘附分子(DSCAM)在大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经细胞中的作用。方法在建立黄芩苷诱导大鼠MSCs分化为神经细胞的基础上,采用免疫细胞化学法、Western blot法等检测DSCAM的表达变化;同时采用RNA干扰技术,观察DSCAM-siRNA转染MSCs后诱导分化情况。结果诱导前大鼠MSCs不表达DSCAM;预诱导液诱导24h,MSCs开始少量表达DSCAM(1.71±0.67)%;黄芩甙诱导6h,部分表达DSCAM(15.79±4.24)%;诱导后3d,DSCAM表达最高(53.16±5.94)%;诱导后6d,DSCAM表达明显下降(28.99±6.72)%。DSCAM-siRNA转染MSCs,DSCAM表达显著下降。而且,诱导前MSCs不表达神经细胞特异性标记蛋白β-ⅡI-tubulin;诱导6h,β-ⅡI-tubulin表达为(1.40±0.79)%,诱导3d达到(41.59±3.17)%,诱导6d为(59.11±4.76)%。但是,DSCAM-siRNA转染MSCs,诱导3d,6d,β-ⅡI-tubulin蛋白的表达显著下降,分别为(28.57±2.91)%和(43.90±12.31)%。结论DSCAM可能在MSCs分化为神经细胞中起到重要的作用。

大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中Notch信号与RhoA/Rho激酶信号的协同作用

目的 探讨Notch信号通路在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化中与RhoA/Rho激酶信号的协同作用.方法 实验分为无血清培养基对照组和盐酸法舒地尔组.采用盐酸法舒地尔诱导大鼠MSCs分化为神经细胞.RT-PCR检测Hes1的表达变化;免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经微丝蛋白亚单位(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化.结果 ①盐酸法舒地尔组MSCs的Hes1 mRNA转录下降(P<0.05).②盐酸法舒地尔可以诱导MSCs向神经细胞分化,NSE、NF-M的阳性表达率显著高于无血清培养基组(P<0.05).结论 盐酸法舒地尔在诱导大鼠MSCs向神经细胞分化过程中,可能存在Notch信号通路与RhoA/Rho激酶通路信号的协同作用,共同促进MSCs向神经细胞分化.

核因子-κB在盐酸法舒地尔诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的作用

目的探讨核因子-κB信号通路在大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向神经元分化中的作用。方法实验分为无血清培养基对照组、盐酸法舒地尔组。采用盐酸法舒地尔诱导大鼠MSCs分化为神经元。免疫细胞化学法检测神经元烯醇化酶（NSE）、神经微管结合蛋白（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达变化及核因子-κB亚基p65核移位情况。结果①盐酸法舒地尔可以诱导MSCs向神经元分化，NSE、MAP-2的表达率高，但对照组无类似情况（P〈0．05）。②盐酸法舒地尔组MSCs的p65核移位明显受抑制，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论盐酸法舒地尔可以抑制核因子-κB活化，可能有利于MSCs向神经细胞分化。