Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化

背景:自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene,Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用,但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。目的:探讨Wnt信号通路和自身免疫调节因子与胚胎干细胞分化的关系。方法:采用两步分化方法定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为内胚层再分化为胸腺上皮祖细胞,然后用Aire shRNA慢病毒感染小鼠胚胎干细胞,嘌呤霉素筛选单克隆稳定株,再采用两步分化方法进行诱导分化,分别于定向诱导分化第0,3,10天,采用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot、Real-Time qPCR检测相关基因及蛋白的表达变化。结果与结论:①定向诱导分化第0天,免疫荧光染色显示SSEA1、OCT4表达呈阳性;②定向诱导分化第3天,免疫荧光染色显示SOX17、FOXA2表达呈双阳性;③定向诱导分化第10天,流式细胞术结果显示EPCAM1、K5、K8表达呈阳性;④与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达升高,Aire蛋白表达降低;⑤与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire mRNA表达升高;⑥与正常培养的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞相比,敲低Aire基因的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平降低。综上所述,Wnt信号通路和Aire共同参与了小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为小鼠胸腺上皮祖细胞的过程。

红细胞膜相关蛋白通过IL-6/STAT3/ROR-γt信号通路抑制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中Th17细胞分化

目的探讨小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中,外源性和内源性红细胞膜相关蛋白(ERMAP)通过白细胞介素6/信号转录及转录激活因子3(IL-6/STAT3)/维甲酸相关孤核受体γt/(ROR-γt)信号通路对辅助性T细胞17(Th17)细胞分化的影响。方法流式细胞术验证不同浓度ERMAP-Ig融合蛋白功能;琼脂糖凝胶电泳鉴定ERMAP基因敲除小鼠。流式细胞术检测ERMAP-Ig融合蛋白在体外对Th17细胞分化影响。40只6周龄普通C57BL/6小鼠随机分为2组建立EAE模型:对照(control)-Ig和ERMAP-Ig组,每组20只;记录临床评分;流式细胞术检测EAE小鼠体内Th17细胞分化情况。40只6周龄已鉴定的野生型和ERMAP基因敲除小鼠分为2组建立EAE模型:ERMAP^(+/+)和ERMAP^(-/-)组,每组20只。记录临床评分;脊髓HE和固蓝(LFB)染色并进行组织学半定量评分。流式细胞术检测IL-17A+CD4+T细胞百分比;Western blotting检测IL-6、白细胞介素17(IL-17)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、ROR-γt蛋白水平表达;Real-time PCR检测IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、STAT3和ROR-γt的mRNA表达;ELISA检测细胞水平IL-17和TNF-α的表达。结果1.外源性ERMAP-Ig融合蛋白抑制体内外Th17细胞分化且减轻小鼠EAE症状。2.与对照组相比,ERMAP^(-/-)组EAE小鼠炎性浸润和脱髓鞘症状加重,Th17分泌IL-17A增加。3.内源性ERMAP基因敲除后,IL-17、TNF-α、IL-6、STAT3及ROR-γt表达均增加。差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ERMAP可能通过IL-6/STAT3/ROR-γt信号通路调控Th17细胞分化,参与小鼠EAE发生发展。

Wnt7a/β-连环蛋白/自身免疫调节因子信号通路参与1型糖尿病的发生

目的探讨NOD/Ltj小鼠自发1型糖尿病(T1D)过程中,胸腺内Wnt信号通路、自身免疫调节因子(AIRE)及T1D组织特异性抗原(TSAs)胰岛素2(Ins2)、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)表达与T1D发生的关系。方法60只雌性NOD/Ltj小鼠分3组:3周组、16周未发病组及16周发病组,每组20只;非空腹血糖值连续2次≥11.1 mmol/L视为发生T1D。胰腺HE染色观察胰岛炎发生情况,抗Ins、CD45免疫组织化学染色显示胰岛β细胞或浸润炎性细胞;Western blotting和Real-time PCR检测胸腺Wnt7a、β-catenin、AIRE、Ins、GAD67蛋白水平和mRNA表达;流式细胞术分析胸腺T细胞比例。结果1.随着T1D发生,胰岛组织结构破坏,大量淋巴细胞浸润,残存胰岛细胞减少;Ins^(+)胰岛β细胞周围见大量CD45^(+)细胞聚集。2.随年龄的增加,胸腺Wnt7a、β-连环蛋白(catenin)、AIRE、Ins和GAD67蛋白水平和mRNA表达降低;同周龄发病组小鼠与未发病组小鼠相比,胸腺Ins表达下降。3.与3周组相比,16周未发病组CD4、CD8单阳性T细胞比例降低;16周发病组CD4、CD8单阳性T细胞比例升高,CD4、CD8双阳性T细胞比例降低。结论Wnt7a/β-catenin信号通路可能通过调控AIRE表达,下调T1D相关TSAs表达,参与T1D发生发展。