Eglin C与2709碱性蛋白酶相互作用分析及亲和纯化方法

Eglin C是来自水蛭中的一种小型热稳定蛋白质,属于马铃薯胰凝乳蛋白酶抑制剂家族,可以抑制弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组织蛋白酶、α-lytic蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等。然而,利用eglin C纯化蛋白酶,尚未见研究报道。本文将化学合成的编码eglin C及其突变体的基因序列,克隆到原核表达载体pQE30,在大肠杆菌BL21获得His6-Tag-eglin C及其突变体的重组蛋白质。SDS-PAGE显示,eglin C蛋白的分子量大约8 kD。His6-Tag-eglin C对胰凝乳蛋白酶、地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶的半抑制剂浓度(IC50)分别为0.20±0.15、0.24±0.19、3.33±0.47和52.46±0.38μmol/L。利用分子对接、基因突变以及荧光光谱等,分析eglin C及其突变体与2709蛋白酶的相互作用。结果显示,2709碱性蛋白酶对eglin C荧光淬灭属于静态淬灭,解离常数为2.60×10^(-7)mol/L,eglin C中的Asn50残基对eglin C和2709碱性蛋白酶的结合发挥重要作用。利用eglin C与蛋白酶的特异结合的特性,构建亲和纯化载体,用于纯化来源于地衣芽孢杆菌的2709碱性蛋白酶,相比常规的蛋白酶纯化,显著简化了操作步骤。

疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠炎性细胞因子的影响

目的:通过基因芯片技术分析疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠炎性细胞因子差异表达基因的影响。方法:按随机数字表法将雄性ICR小鼠分为正常组(N组)、流感病毒性肺炎模型组(M组)、奥司他韦对照组(C组)及疏风宣肺解毒方高、中、低剂量组(SH、SM、SL组),每组10只。通过流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1(0.05 mL)滴鼻建立小鼠流感病毒性肺炎模型;N组以0.05 mL生理盐水滴鼻。SH、SM、SL组于滴鼻感染后2 h灌胃疏风宣肺解毒方,含药浓度分别为临床用药的2倍量、等量、1/2量(约为3.8、1.9、1.0 kg/L),每日1次,每次0.2 mL,连用4 d;C组灌服奥司他韦2.5 kg/L;N组和M组灌服蒸馏水。第5天取小鼠全肺,提取肺组织总RNA,与小鼠全基因芯片杂交并检测,筛选参与炎症相关通路中的靶基因。扫描杂交芯片,计算芯片探针信号在各组与M组的强度表达比值,筛选差异表达基因,其中P<0.05且log2比值>1为上调基因,P<0.05且log2比值<-1为下调基因。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测白细胞介素(IL-1、IL-8)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的mRNA表达。结果:与N组相比,M组差异基因表达IL-1、IL-8、ICAM-1明显上调(log2N组/M组分别为2.62、2.07、1.41,均P<0.05)。与M组相比,SH、SM、SL、C组差异基因表达IL-1、IL-8、ICAM-1均明显下调(log2SH组/M组分别为-1.91、-1.85、-0.88,log2SM组/M组分别为-3.10、-1.74、-1.84,log2SL组/M组分别为-1.89、-1.39、-0.53,log2C组/M组分别为-2.46、-1.52、-1.44,均P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,M组IL-1、IL-8、ICAM-1的mRNA表达水平均较N组显著升高〔IL-1(2^-ΔΔCT):4.63±0.24比1.01±0.13,IL-8(2^-ΔΔCT):6.28±0.13比1.02±0.09,ICAM-1(2^-ΔΔCT):2.90±0.18比1.02±0.12,均P<0.05〕。SH、SM、SL和C组IL-1、IL-8、ICAM-1的mRNA表达水平均较M组组显著降低〔IL-1(2^-ΔΔCT):2.12±0.32、1.71±0.07、2.05±0.16、1.66±0.13比4.63±0.24,IL-8(2^-ΔΔCT):3.89±0.13、2.08±0.19、2.98±0.20、2.02±0.12比6.28±0.13,ICAM-1(2^-ΔΔCT):1.72±0.93、1.34±0.14、1.53±0.25、1.17±0.12比2.90±0.18,均P<0.05〕,但SH、SM、SL和C组间差异无统计学意义。结论:疏风宣肺解毒方通过下调IL-1、IL-8、ICAM-1炎性细胞因子相关基因的表达,抑制流感病毒感染后小鼠的炎症损伤。