重组HSA-hG-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的表达

为了延长G-CSF半衰期，利用甲醇酵母表达重组人血清白蛋白融合的集落细胞刺激因子（rHSA-G-CSF）。用PCR方法从人胎肝cDNA文库扩增出HSA cDNA序列，hG—CSFcDNA序列从大肠表达载体中酶切获取。将HSA和hG—CSF两片段连接后，克隆到酵母分泌型表达载体pGENYK中，酶切线性化后原生质体转化导入酵母细胞进行整合。工程菌经发酵罐培养表达，层析法分离纯化融合蛋白。纯化的融合蛋白经Western印迹分析表明具有HSA和G—CSF的免疫原性，体外生物学活性分析表明，同等尔数的融合表达产物的活性为E．coli表达G—CSF单体的活性的50％以上。体内动物实验研究表明，经HSA融合的G．CSF的半衰期为G—CSF单体的15～20倍。甲醇酵母表达的融合HSA的G-CSF具有比G-CSF更长的半衰期，有良好的临床应用前景。

阴离子交换HPLC法精确测定肝素钠中的多硫酸软骨素和硫酸皮肤素

目的:建立可同时测定肝素钠中的多硫酸软骨素(OSCS)和硫酸皮肤素(DS)等杂质的有关物质检测方法。方法:应用高效液相色谱-紫外可见光检测器,2种阴离子交换树脂为填充剂的色谱柱,在pH 3.0的酸性体系下,设计了5种由不同流动相体系、洗脱梯度和不同阴离子交换柱组成的分析方法,比较了其分离度。结果:5种方法中以方法 E灵敏度最高,理论塔板数和分离度也最高,多硫酸软骨素的检测限和定量限分别为0.025%和0.03%;硫酸皮肤素的检测限和定量限分别为0.03%和0.05%;多硫酸软骨素和硫酸皮肤素的加标回收率分别为102.5%和96.0%。结论:采用方法 E的弱阴离子交换HPLC法与现有药典标准方法相比,具有更好的灵敏度和准确度。

聚乙二醇单修饰的重组人粒细胞集落刺激因子突变体的纯化与分析

目的获得高活性的聚乙二醇定点单修饰的产物PEG-rmhG-CSF-Cys176。方法用聚乙二醇马来酰亚胺基和高活性的重组人粒细胞集落刺激因子突变体(rmhG-CSF)的半胱氨酸(Cys)基团特异性结合,并用离子交换层析分离纯化修饰产物,通过高效凝胶过滤色谱检测纯度,MTT法检测体外的生物活性。结果蛋白纯度为97%,体外生物活性为0.8×108IU·mg-1。结论半胱氨酸反应性PEG和游离Cys的结合是在rmhG-CSF活性区以外的位置C末端,修饰后的蛋白活性基本未受影响。