Exendin-4通过促进自噬减少非酒精性脂肪性肝病细胞模型的脂质沉积

目的探究Exendin-4改善肝细胞脂质沉积的作用机制,讨论Exendin-4治疗非酒精性脂肪肝病的可能机制。方法对照组(人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2,不做任何处理);棕榈酸钠(PA)组(LO2与HepG2分别进行PA处理,以构建肝细胞脂肪变性模型);PA+Exendin-4组(LO2与HepG2分别进行PA与Exendin-4共处理);PA+Exendin-4+3BDO组(LO2与HepG2分别进行Exendin-4与3BDO共处理)。通过油红O染色实验、CCK8实验,检测对照组、PA组、PA+Exendin-4组的脂质沉积程度与细胞增殖能力,并通过Western blot检测信号通路关键分子p-mTOR、m-TOR、p-AKT、AKT,以及自噬相关蛋白LC3-I/II和p62的表达;通过Western blot与免疫荧光实验,检测LO2与HepG2细胞中GLP-1R表达情况;通过Western blot,检测对照组、PA+Exendin-4组、PA+Exendin-4+3BDO组中LC3-I/II和p62的表达。结果油红O染色实验表明,PA诱导后细胞中脂质明显增加,PA+Exendin-4组脂质沉积程度较PA组降低;细胞增殖实验表明,PA组细胞增殖水平较对照组明显受抑制(P<0.01);PA+Exendin-4组细胞增殖水平较PA组升高(P<0.05);免疫荧光实验表明,人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2细胞株中均有GLP-1R表达;Western blot表明,PA+Exendin-4组p-mTOR的表达较PA组下调,p-AKT的表达较PA组上调。Exendin-4可下调自噬相关蛋白p62,而上调LC3-II的表达,而这一结果可被3BDO逆转。结论Exendin-4可能通过直接作用于细胞上GLP-1R,激活AKT-mTOR信号通路,进而促进自噬;同时,Exendin-4有助于缓解PA作用下肝细胞的脂质沉积过程,并促进细胞增殖。提示Exendin-4在PA作用下肝细胞的脂质沉积过程中具有重要作用。

YWHAZ在小鼠早期胚胎发育过程中的作用

为了探究YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的表达、定位和作用,本试验利用RT-PCR和Western blot方法检测Ywhaz基因及其编码蛋白在小鼠早期胚胎发育中的表达;利用免疫荧光技术检测YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中的定位;使用特异性的siRNA沉默合子中的Ywhaz,在胚胎发育的1.5,2.5,3.0,3.5,4.5,5.0 dpc分别观察2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚的发育率,阐明在合子中沉默Ywhaz基因对小鼠早期胚胎发育的影响。结果显示,Ywhaz mRNA及其编码蛋白在小鼠1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚中均有表达,YWHAZ蛋白定位在小鼠早期胚胎的细胞质和细胞核中。Ywhaz沉默组的2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚的发育率均极显著低于对照组(P<0.01),沉默组5.0 dpc囊胚率显著高于其4.5 dpc囊胚率(P<0.05)。结果表明,Ywhaz mRNA及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎中有表达,其蛋白主要定位在早期胚胎的细胞核和细胞质中;在合子中沉默Ywhaz基因可导致小鼠早期胚胎发育率降低且存在明显的胚胎发育延迟现象。

猪睾丸组织的形态学观察、细胞凋亡和巴豆酰化修饰

制作睾丸组织切片,运用HE染色和细胞TUNEL染色分别观察不同发育阶段猪睾丸的形态学和细胞凋亡;提取睾丸组织蛋白,利用免疫印迹检测不同发育阶段猪睾丸蛋白的Kcr修饰水平;最后利用免疫荧光技术检测Kcr蛋白在猪睾丸组织中的定位。结果显示,随着月龄的增长,猪睾丸精细管管腔直径增加,睾丸组织在4月龄时精细胞开始分裂,凋亡细胞开始显著增加;睾丸细胞中有大量蛋白发生Kcr修饰,大部分蛋白的Kcr修饰水平会随着月龄的增加而减少;免疫荧光结果显示在猪睾丸间质细胞、足细胞和生精细胞中都能检测到Kcr蛋白定位。试验表明,在猪睾丸发育过程中,4月龄时精细胞开始分裂,凋亡细胞显著增加,大部分蛋白Kcr修饰水平有下降趋势且主要定位在睾丸体细胞和生精细胞中。