整合蛋白α5,β1亚基的过表达对肝癌细胞粘附和迁移的影响

目的 :研究整合蛋白α5 ,β1亚基的过表达与肝癌细胞粘附能力、迁移能力、集落形成能力、以及与肝癌细胞凋亡的关系。方法 :用已建立的单独转染α5 ,β1整合蛋白亚基的细胞株α5 3 772 1,β1 6 772 1和共转α5和 β1整合蛋白亚基的细胞株α5 β1 6 772 1;采用结晶紫染色法测定细胞的粘附能力、细胞的迁移能力 ;应用荧光染色法和流式细胞仪法测定细胞凋亡速度。结果 :转染后细胞与主要胞外基质蛋白 纤连蛋白的粘附分别为对照细胞的 1.39,1.34,1.7倍 ;与层粘连蛋白 (Ln)的粘附为对细胞的 1.3、2 .6、1.98倍 ;α5 ,β1整合蛋白转染株细胞在Fn上的迁移能力分别增加 1.2 2、0 .78、1.38倍。集落形成能力分别下降 38% ,35 %和 5 2 %。在无血清培养时 ,α5 ,β1整合蛋白转染株细胞的凋亡百分率分别提高 2 .4、0 .5 3、1.79倍。结论 :将α5 β1整合蛋白导入人肝癌细胞引起α5 β1整合蛋白过表达 ,可显著改变细胞的生长 ,粘附和迁移能力 ,从而导致体外集落形成能力明显下降 。

TNF-α对人肝癌细胞E-钙粘蛋白、α_5β_1整合蛋白及粘着斑激酶蛋白表达的影响

目的 研究应用肿瘤坏死因子 (TNF α)单独处理SMMC 772 1肝癌细胞不能引起肝癌细胞凋亡的原因。方法 采用免疫组化ABC法 ,结合图像分析仪及流式细胞术和Western印迹方法测定SMMC 772 1细胞表面E 钙粘蛋白 (E cadherin)、α5β1整合蛋白 (α5β1intergrin)、粘着斑激酶 (FAK )表达及粘着斑激酶磷酸化的程度。结果 在肿瘤坏死因子的作用下 ,E 钙粘蛋白的表达略有下降 ,但无明显差异。整合蛋白α5亚基的表达明显下降 ,而整合蛋白 β1亚基表达基本无变化。粘着斑激酶的蛋白表达随着肿瘤坏死因子浓度的增加略有下降 ,但变化不明显 ,粘着斑激酶的磷酸化程度无明显的变化。结论 单独用肿瘤坏死因子处理SMMC 772 1肝癌细胞后 ,并没有阻断由整合蛋白α5β1亚基及E 钙粘蛋白介导的 2条信号通路 ,且由胱冬肽酶 (caspases)介导的凋亡也没有被完全启动 ,不足以引起细胞的凋亡。

佛波酯促进NIH3T3细胞的铺展和聚焦粘附激酶的酪氨酸磷酸化

100nmol/L佛波酯(12-O-tetradecanoylphobol-13-acetate,TPA)能明显促进NIH3T3细胞在纤连蛋白(Fn)上的铺展,该作用能分别被酪氨酸激酶(tyrosinekinase,TK)抑制剂4′,5,7-三羟基异黄酮(genistein)和蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)抑制剂calphostinC和神经鞘氨醇(sphingosine)所抑制.TPA作用于结合到Fn上的NIH3T3细胞,使其聚焦粘附激酶(focaladhe-sionkinase,FAK)的酪氨酸磷酸化程度较未处理细胞升高,于30min时达对照的204.0%,并存在浓度依赖性;该变化分别被上述抑制剂所拮抗;未经TPA处理的NIH3T3细胞和纤连蛋白结合诱导的FAK酪氨酸磷酸化亦分别被上述抑制剂所抑制.细胞松弛素D则无论TPA作用与否,都能完全阻断NIH3T3细胞的铺展和FAK的酪氨酸磷酸化.以上结果提示,TPA促进NIH3T3细胞在Fn上铺展的信号转导机制,与PKC的激活有关,进一步则可能通过影响FAK的酪氨酸磷酸化来实现,同时需要细胞骨架的参与;NIH3T3细胞和Fn结合并诱导FAK酪氨酸磷酸化的过程亦依赖于PKC和完整的细胞骨架.

佛波酯(TPA)促进NIH3T3细胞α_5β_1整合蛋白的合成

佛波酯(TPA)是潜在促肿瘤剂,也是蛋白激酶PKC激活剂.TPA能在极低浓度下替代DG激活PKC,从而导致一系列细胞功能变化.应用100nmol/LTPA作用于NIH3T3细胞,观察NIH3T3细胞的粘附变化,发现TPA可促进NIH3T3细胞与基质纤连蛋白的粘附,进一步研究Fn的主要受体α5β1整合蛋白在细胞表面含量,发现TPA作用24h使α5及β1含量分别增加523%和516%.应用3H甘露糖标记N糖链和凝集素柱层析方法分析TPA作用后细胞N糖链总量和组分比,结果均与对照组相仿,说明是通过增加细胞合成整合蛋白α5及β1亚基含量实现的.在TPA作用于细胞的同时,加入PKC抑制剂Sphingosine,发现α5、β1含量和细胞与Fn的粘附均回复至对照组水平,提示TPA增加α5β1整合蛋白合成而增加的细胞与Fn粘附作用,是由PKC介导完成的.此外还发现酪氨酸蛋白激酶抑制剂也阻断TPA增加α5β1整合蛋白含量的作用.

黏着斑激酶对肝癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨降低黏着斑激酶 (FAK)的表达对FAK高表达的人肝癌细胞株SMMC 772 1恶性生物学行为影响。方法 用Western杂交法比较不同肝癌细胞株FAK含量的差别 ,构建FAK反义质粒 ,转染至FAK高表达的细胞株 ,研究其多种细胞生物学行为的变化。结果 SMMC 772 1FAK含量比正常人肝细胞L0 2明显增高 ,转染FAK反义质粒后 ,SMMC 772 1细胞生长受到抑制 ,软琼脂培养克隆形成率下降 ;细胞周期分析 ,S期细胞下降 15 % ;黏附能力下降 ;细胞表面整连蛋白含量不变。结论 在SMMC 772 1中存在FAK过表达 ,降低FAK表达能部分逆转该肝癌细胞株的恶性表型。