心肌Cav1.2钙通道NT片段的提取纯化及其与CaM的相互作用

目的探讨心肌Cav1.2钙通道NT蛋白片段提取与纯化的方法,并研究其与CaM的相互作用。方法将NT的cDNA插入pGEX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL-21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导NT的GST融合蛋白表达,GS-4B beads分离纯化,Pre Scission蛋白酶切除GST标签,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDSPAGE)检测蛋白纯度和相对分子质量。采用GST pull-down实验研究NT片段与Ca M的相互作用。结果 SDS-PAGE结果显示成功纯化获得NT蛋白片段,且具有较高的纯度。GST pull-down实验结果显示NT可与Ca M结合,且具有浓度依赖性。结论本研究成功制备与纯化了心肌Cav1.2钙通道NT蛋白片段,为深入研究蛋白相互作用及NT的生物学功能奠定了基础。

超声破碎法联合应用DTT提取纯化Ca_V1.2钙通道CT3蛋白

目的探讨心肌Ca_V1.2钙通道CT3蛋白片段提取与纯化的方法。方法将CT3的cDNA插入pG EX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL-21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导CT3的GST融合蛋白表达,并采用超声破碎法进行分离纯化,在10mmol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)存在的情况下,PreScission蛋白酶切除GST标签,凝胶电泳鉴定CT3蛋白,检测蛋白纯度和相对分子质量。结果 SDSPAGE结果显示,超声破碎法可以纯化得到GST-CT3融合蛋白,且单纯应用PreScission蛋白酶酶切GST-CT3,得到的CT3蛋白片段浓度较低,而采用PreS cission蛋白酶联合应用DTT则可以成功提取纯化出浓度较高的CT3蛋白片段。结论超声破碎法联合应用DTT与PreScission蛋白酶能够提取纯化出高浓度和纯度的CT3蛋白片段,为深入研究CT3的生物学功能奠定了基础。