融合蛋白TAT-RabGEF1原核表达载体的构建及蛋白表达

【目的】构建PET28a-TAT-RabGEF1重组质粒载体,在E.coli Rosetta(DE3)菌株中高效表达并纯化融合蛋白,研究TAT-RabGEF1融合蛋白对肥大细胞的跨膜转导活性。【方法】以小鼠组织cDNA为模板,设计上游和下游含有限制性酶切位点和TAT序列的引物,PCR扩增目的片段TAT-RabGEF1,并通过双酶切构建PET28a-TAT-RabGEF1重组质粒载体,在E.coli Rosetta(DE3)大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,产物用亲和层析柱纯化后测量浓度及鉴定。CCK-8检测融合蛋白的细胞毒性,并用荧光显微镜及荧光分光光度计定性定量观察其对小鼠肥大细胞瘤细胞P815的转导活性。【结果】成功构建了PET28a-TAT-RabGEF1重组载体,高效表达了具有较高特异性,相对分子质量约为57 ku的融合蛋白TAT-Rab GEF1,0.1、1、10μmol/L浓度的TAT-RabGEF1蛋白对细胞无明显毒性,荧光显微镜显示1μmol/L浓度的融合蛋白TAT-RabGEF1具有快速转导进入P815细胞内的能力,且为进入细胞的饱和浓度。【结论】通过TAT-RabGEF1的原核表达和蛋白纯化分析,证实了TAT-PTD的跨膜转导活性,为研究RabGEF1在肥大细胞激活途径中的作用提供了物质基础。

新壮态植物生长促进液对茶树生长的作用

2013年夏季,高温干旱肆虐我国长江中下游地区.浙江茶区遭遇创记录的持续高温干旱,杭州连续40多天基本无雨,最高气温达41.6℃,连续5次破1951年有气象记录以来的历史最高温度,浙江奉化更是高达43.5℃,绍兴、新昌、嵊州和富阳等多个县市的最高气温超过42.0℃.我国江苏、安徽、江西、福建、湖南、贵州和重庆等省市同样遭遇不同程度的高温.连续高温干旱对我国茶叶生产造成了严重的影响.据调查,浙江主要产茶县市的受害茶园多在5％ ～ 60％之间,部分严重受害的茶树甚至干旱致死,而受害较轻的茶园也有不同程度的枯株落叶和叶片灼伤症状.为了尽快恢复茶树生长,我们选用新壮态植物生长促进液进行了试验.

蛋白转导Rab GEF1减轻小鼠肝脏缺血再灌注所致的肺损伤

目的:探讨转录反式激活因子-Rab鸟嘌呤核苷酸交换因子1(Tat-RabGEF1)融合蛋白对小鼠肝脏缺血再灌注(IR)所致肺损伤的作用及其可能的机制。方法:选用雄性C57BL/6小鼠24只,按随机数字表法分为假手术(sham)组、IR组和Tat-RabGEF1组,每组8只。采用肝脏缺血90 min再灌注4 h制备肺损伤模型,Tat-Rab-GEF1组于再灌注即刻经尾静脉注射Tat-RabGEF1 (10 mg/kg)。再灌注4 h后处死小鼠,收集支气管肺泡灌洗液(BALF),采用ELISA法检测BALF中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6 (IL-6)和白细胞介素1β(IL-1β)的含量;取肺组织进行病理学检测,测定湿/干重比、β-氨基己糖苷酶(β-Hex A)和髓过氧化物酶(MPO)水平,并采用Western blot法测定肺组织类胰蛋白酶的表达水平。结果:(1)肝缺血90 min再灌注4 h肺组织病理损伤明显,湿/干重比增高,Tat-RabGEF1尾静脉注射明显减轻肺脏病理损伤。(2)与IR组比较,Tat-RabGEF1组BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β浓度,以及肺组织β-Hex A、MPO水平和类胰蛋白酶表达显著降低(P <0.05)。结论:体内蛋白转导Rab GEF1减轻肝IR所致的肺损伤,减少肺组织炎症反应和细胞因子水平,其机制可能与抑制肥大细胞激活有关。