锌离子依赖金属蛋白酶1(Zmp1)抑制小鼠RAW264.7细胞增殖以及吞噬体-溶酶体的融合

目的观察卡介苗（BCG）的锌离子依赖金属蛋白酶1（Zmp1）对RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖以及吞噬体-溶酶体融合的影响。方法在大肠杆菌BL21（DE3）中克隆表达Zmp1,用金属螯合磁珠纯化;用纯化的Zmp1处理RAW264.7细胞,采用CCK-8法检测（0、24、48、72、96）h的细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期分布;用减毒沙门菌感染RAW264.7细胞诱导吞噬体形成后,用Zmp1处理细胞,在吞噬体内的减毒沙门菌和溶酶体的溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）分别用相应Alexa Fluor（R）350抗沙门菌抗体（蓝色荧光）和Cy5抗LAMP1抗体（红色荧光）标记,通过荧光显微镜观察RAW264.7细胞内两种荧光,将其重合分析吞噬体与溶酶体融合情况。结果用Zmp1蛋白处理细胞48 h后,细胞增殖活性明显降低;处理48 h后,细胞周期中G1期细胞比例下降,S期比例增高;采用双荧光标记感染沙门菌的RAW264.7细胞,Zmp1处理后显示紫色荧光的吞噬溶酶体融合减少。结论 Zmp1抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞增殖,抑制吞噬体-溶酶体融合。

锌依赖的金属蛋白酶1促进巨噬细胞凋亡

目的构建锌依赖的金属蛋白酶1(zmp1)基因的真核表达质粒,探讨其对巨噬细胞凋亡的影响。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增zmp1基因;克隆到真核表达质粒p EGFP-N1的多克隆位点中,构建真核表达质粒p EGFP-N1-zmp1并转染RAW264.7细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,实时定量PCR(qRT-PCR)检测zmp1 mRNA的水平;藻红蛋白标记的膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-PE/7-AAD)双染色结合流式细胞术检测Zmp1蛋白对细胞凋亡影响。结果扩增出zmp1基因;真核表达质粒经过XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切及基因测序鉴定构建成功;转染细胞24 h后,经荧光倒置显微镜观察到绿色荧光;qRT-PCR结果显示转染p EGFP-N1-zmp1的RAW264.7细胞zmp1 mRNA的表达显著升高;转染后48 h,细胞早期凋亡率有所增加。结论在RAW264.7细胞中成功表达了Zmp1并能促进巨噬细胞凋亡。

新型基因组编辑蛋白FnCpf1的表达、鉴定及多克隆抗体的制备

目的:构建土拉弗朗西丝菌Novicida亚种Cpf1蛋白编码基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、纯化重组Fn Cpf1蛋白后,制备兔抗Fn Cpf1多克隆抗体。方法:利用PCR技术扩增Fn Cpf1基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到纯度较高的Fn Cpf1蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备Fn Cpf1多克隆抗体,并用间接ELISA法检测兔抗血清效价、Western blot鉴定其特异性。结果:扩增得到3 900 bp的目的基因片段,克隆到表达载体pET-32a(+)后,通过双酶切及测序证实pET-32a(+)-Fn Cpf1表达载体构建成功,可诱导表达相对分子质量160 k D的目的蛋白,经SDS-PAGE分析其为可溶性,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到纯度为95%以上的Fn Cpf1蛋白,制备多克隆抗体并检测兔抗Fn Cpf1抗血清ELISA效价达1:512 000,Western blot结果显示制备的抗体可较好地与Fn Cpf1蛋白特异性结合。结论:在原核系统中成功表达了Fn Cpf1重组蛋白,并用纯化后的蛋白制备出兔抗Fn Cpf1抗体,效价及特异性均良好,为进一步探讨Cpf1蛋白的生物学特性打下实验基础。

锌离子依赖的金属蛋白酶-1体内抑制分枝杆菌的抗原处理

目的:在小鼠体内观察卡介苗的锌离子依赖的金属蛋白酶-1(Zinc metalloprotease-1,Zmp1)对结核分枝杆菌抗原PPE68处理的影响。方法:6~8周龄BALB/c小鼠随机分为5组,分别为p Bud CE4.1空质粒对照组(n=7)、表达PPE68抗原肽的p BudCE4.1-PPE68p质粒组(n=9)、表达PPE68抗原的p Bud CE4.1-PPE68质粒组(n=9)、PPE68抗原和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68-Zmp1质粒组(n=10)及PPE68抗原肽和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68p-Zmp1质粒组(n=8)。各组质粒电转化减毒沙门菌株SL7207构建相应的重组沙门菌。以灌胃方式将各组沙门菌免疫小鼠3周。收集小鼠血液和肺肠灌洗液,采用ELISA法测定血清中IFN-γ、IL-12含量及肺与肠道s Ig A的含量;分离培养脾细胞,用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果:与PPE68抗原组相比,PPE68和Zmp1共表达组的IFN-γ(117.29±16.86,P=0.034)、IL-12(40.46±7.11,P=0.0037)、淋巴细胞刺激指数SI(3.30±0.49,P=0.004)均降低;与PPE68抗原肽组相比,PPE68抗原肽和Zmp1共表达组相应因子含量下降不明显,IFN-γ(132.75±28.40,P=0.070)、IL-12(55.43±11.78,P=0.198)、SI(4.70±1.57,P=0.124)。结论:卡介苗的Zmp1影响结核分枝杆菌抗原PPE68的处理过程,这可能是影响BCG免疫效果的重要原因。