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棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析
被引量:
14
1
作者
雷建峰
伍娟
+5 位作者
陈晓俊
於添平
倪志勇
李月
张巨松
刘晓东
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2015年第19期3794-3802,共9页
【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉(Gossypium barbadense L.)Gb U6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中(花粉)高效转录的Gb U6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆...
【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉(Gossypium barbadense L.)Gb U6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中(花粉)高效转录的Gb U6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的Gb U6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列,利用Primer5.0软件设计5对引物,进行第一轮能覆盖完整Gb U6启动子的PCR扩增,产物克隆测序正确后,再利用transfer PCR法将Gb U6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中;第二轮扩增产物测序正确后,运用DNAMAN软件对克隆成功的5个Gb U6启动子序列中具有转录功能的必要元件进行分析;然后以p BI101质粒DNA为模板,PCR扩增并克隆GUS报告基因,经酶切鉴定、测序正确后,用BbsⅠ酶切GUS,连入经同样酶切后的5个Gb U6启动子对应的CRISPR/Cas9基因组编辑载体中,转化、酶切鉴定,获得对应的5种Gb U6::GUS的表达载体。将含有Ca MV35S启动子驱动的GUS表达载体作为棉花花粉瞬时转化的阳性对照,以上述6种表达载体DNA为模板,采用高保真酶的PCR扩增法获得高浓度DNA片段,利用基因枪轰击法将5种Gb U6::GUS和阳性对照的DNA片段分别转化棉花花粉,并进行GUS染色,最后用体式显微镜观察染色情况。每个启动子的基因枪转化重复3次,最后根据染色深浅筛选出在棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子。【结果】经两轮PCR扩增后获得5种Gb U6启动子,启动子长度分别为1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp,并构建获得了相应的5种CRISPR/Cas9基因组编辑载体;对拟南芥和克隆的5个Gb U6启动子序列进行序列比对,结果表明,Gb U6启动子区与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框,而且这两个元件之间的距离也非常固定;用Gb U6::GUS的DNA片段瞬时转化棉花花粉,发现基因枪瞬时转化的3次重复结果显示克隆得到的5个Gb U6启动子有4个能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色。其中Gb U6-5P::GUS的染色相对较深,接近于Ca MV35S启动子。【结论】成功克隆了棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子,为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了有效的启动子。
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关键词
棉花
GbU6启动子
克隆
花粉
瞬时表达
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职称材料
题名
棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析
被引量:
14
1
作者
雷建峰
伍娟
陈晓俊
於添平
倪志勇
李月
张巨松
刘晓东
机构
新疆农业大学农学院/教育部棉花工程研究中心
出处
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2015年第19期3794-3802,共9页
基金
国家自然科学基金(31470289)
新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJGRI2015084)
文摘
【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉(Gossypium barbadense L.)Gb U6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中(花粉)高效转录的Gb U6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的Gb U6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列,利用Primer5.0软件设计5对引物,进行第一轮能覆盖完整Gb U6启动子的PCR扩增,产物克隆测序正确后,再利用transfer PCR法将Gb U6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中;第二轮扩增产物测序正确后,运用DNAMAN软件对克隆成功的5个Gb U6启动子序列中具有转录功能的必要元件进行分析;然后以p BI101质粒DNA为模板,PCR扩增并克隆GUS报告基因,经酶切鉴定、测序正确后,用BbsⅠ酶切GUS,连入经同样酶切后的5个Gb U6启动子对应的CRISPR/Cas9基因组编辑载体中,转化、酶切鉴定,获得对应的5种Gb U6::GUS的表达载体。将含有Ca MV35S启动子驱动的GUS表达载体作为棉花花粉瞬时转化的阳性对照,以上述6种表达载体DNA为模板,采用高保真酶的PCR扩增法获得高浓度DNA片段,利用基因枪轰击法将5种Gb U6::GUS和阳性对照的DNA片段分别转化棉花花粉,并进行GUS染色,最后用体式显微镜观察染色情况。每个启动子的基因枪转化重复3次,最后根据染色深浅筛选出在棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子。【结果】经两轮PCR扩增后获得5种Gb U6启动子,启动子长度分别为1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp,并构建获得了相应的5种CRISPR/Cas9基因组编辑载体;对拟南芥和克隆的5个Gb U6启动子序列进行序列比对,结果表明,Gb U6启动子区与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框,而且这两个元件之间的距离也非常固定;用Gb U6::GUS的DNA片段瞬时转化棉花花粉,发现基因枪瞬时转化的3次重复结果显示克隆得到的5个Gb U6启动子有4个能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色。其中Gb U6-5P::GUS的染色相对较深,接近于Ca MV35S启动子。【结论】成功克隆了棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子,为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了有效的启动子。
关键词
棉花
GbU6启动子
克隆
花粉
瞬时表达
Keywords
cotton
GbU6 promoter
cloning
pollen
transient expression
分类号
S562 [农业科学—作物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析
雷建峰
伍娟
陈晓俊
於添平
倪志勇
李月
张巨松
刘晓东
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2015
14
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