抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅴ CD3AK介导的MHC非限制性溶瘤作用的机制分析

MHC(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类抗原缺失是一些肿瘤细胞逃逸抗原特异性CTL攻击的重要机制。CTL能否通过MHC非限制性，MHC Ⅰ类非依赖性机制杀伤肿瘤细胞是值得深入探讨的。我们用抗CD3单抗和rIL-2共刺激法诱导的CD3AK作为效应细胞，研究了CD3AK对两株MHC Ⅰ类阴性肿瘤细胞株K562和Daudi杀伤作用，

CD_3AK细胞介导的MHC非限制性溶瘤作用机制的初步研究

本研究表明体外激活扩增的CD_3AK细胞可以MHC非限制性方式杀伤MHC I类抗原阴性NK敏感的K562细胞和MHC I类抗原阴性NK不敏感的Daudi细胞,杀瘤机制与诱导靶细胞坏死和/或凋亡有关。

抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅳ抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱导的PBL增殖与凋亡共存现象

抗CD3单抗TCR／CD3复合物中的CD3分子相互作用，通过信号传导系统引起T细胞功能的不同变化，如诱导T细胞活化增殖，诱导无反应性(unresponsiveness)和细胞凋亡。但抗CD3单抗这几种性质不同，看似矛盾的作用之间有何内在联系及规律是值得深入探讨的。

CD_3AK细胞与LAK细胞的比较

抗ＣＤ３单抗和ｒＩＬ－２共刺激法诱生扩增的ＣＤ３ＡＫ与用等量ｒＩＬ－２诱生扩增的ＬＡＫ间有明显差异：１）扩增倍数和细胞毒活性强度及其动态学不同：在诱生初期，ＣＤ３ＡＫ细胞数下降，细胞扩增倍数低于ＬＡＫ（０．８３对１．７，Ｐ＜０．０１）；对Ｋ５６２的细胞毒活性低于ＬＡＫ（３８％对４３．９％，Ｐ＞０．０５），诱生８天后ＣＤ３ＡＫ的扩增倍数和细胞毒活性都上升并超过ＬＡＫ（５．１３对１．４，Ｐ＜０．０１；４９．４％对２６％，Ｐ＜０．０５）。２）细胞表型不同：ＣＤ３ＡＫ中Ｔ细胞较多，ＬＡＫ细胞中ＮＫ表型细胞百分率高。

抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅰ 抗CD3单抗和rIL-2共刺激对PBMC的激活作用

本实验结果表明采用抗CD3单抗和rIL-2共刺激外周血单个核细胞(Peripheral blood mononueleacells，PBMC)可诱导其增殖、活化、分化为具有杀瘤活性的抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞 (Anti CD3 monoclcnal anybody activated killer cells．CD3AK)。(1)抗CD3单抗和rIL-2共刺激可诱导PBMC增殖，

抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅱ CD3AK的免疫生物学特征

本实验采用倒置显微镜、光学显微镜、电子显微镜和荧光激活的细胞分类器(FACS)分析了抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增的人CD3AK的免疫生物学特征。经抗CD3单抗和rIL-2共刺激后细胞形态学发生明显的变化，细胞异型性明显，有些体积增大，呈圆形或不规则形，往往形成集落：有些细胞体积变小。

抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅲ CD3AK与常规LAK细胞的比较

抗CD3单抗激活的杀伤细胞(Anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells．CD3AK)是用抗CD3单抗(Anti-monoclonal antibody，Anti-CD3 mAb)激活的一类杀伤细胞，具有较强的增殖能力和细胞毒活性。在CD3AK诱生扩增过程中除抗CD3单抗外也需要rIL-2作为生长因子，这就提出一个问题。

转输正常小鼠脾细胞悬液对小鼠白血病(L615)保护作用机理的研究

本室过去的工作表明转输正常小鼠脾细胞悬液对小鼠白血病L615有明显的保护作用,并且可以用普通条件下及SPF(SpecificPathogen free)条件下饲养的小鼠重复。本实验在此基础上探讨了诱导保护作用的机制。材料和方法 (一)动物:所用动物均为615近交系小鼠,体重20-26克,自中国医学科学院血液学研究所引入,在本实验室饲养繁殖。 (二)瘤株:L615,系615系小鼠的T淋巴细胞性白血病,移植成功率为100％。

炒紫苏子醇提取物对过敏模型小鼠的抗过敏作用及机制

目的观察炒紫苏子醇提取物对过敏模型小鼠血清总IgE水平和特异IgE水平的影响。方法采用ELISA法测定卵白蛋白(OVA)致敏小鼠血清总IgE水平;采用大鼠异种被动皮肤过敏反应测定特异IgE水平;采用小鼠主动皮肤过敏反应——耳肿胀试验和小鼠主动全身过敏反应研究炒紫苏子醇提取物的抗过敏作用。结果炒紫苏子醇提取物0.32、0.64、1.28g/kg各剂量组能明显降低小鼠血清总IgE水平(P<0.05、0.01),并呈剂量依赖关系,也明显降低小鼠特异IgE水平(P<0.05、0.01),1.28g/kg剂量抑制小鼠特异IgE水平好于阳性对照色苷酸钠(P<0.01);小鼠主动皮肤过敏反应结果表明,与木犀草素相同,炒紫苏子醇提取物各剂量明显抑制小鼠耳肿胀(P<0.05、0.01);主动全身过敏反应结果表明,炒紫苏子醇提取物各剂量组小鼠OVA攻击死亡率明显降低,小鼠存活时间明显延长,其中1.28g/kg剂量组和木犀草素组死亡率最低,存活时间最长。结论炒紫苏子醇提取物通过明显降低小鼠血清总IgE和特异IgE水平,发挥抗过敏作用。

榄香烯或热休克对人肝癌细胞HepG_2 HSP70膜表达及多种HSP基因表达的影响

目的 :研究榄香烯或热休克对人肝癌细胞HepG2 HSP70膜表达及多种HSP基因表达的影响。方法 :免疫荧光和FCM观察榄香烯 (5 0 μg ml,1h)或热休克 (42℃ ,1h)处理后肿瘤细胞HSP70的膜表达 ,放线菌素D阻断基因转录。应用人类基因表达谱芯片分析经榄香烯或热休克处理的人肝癌细胞HepG2 多种热休克蛋白基因及与热休克蛋白调控相关基因表达谱的改变。结果 :榄香烯或热休克处理 1h后 ,肿瘤细胞膜表面HSP70的表达均有增高 ,而以榄香烯处理为明显 ,放线菌素D的加入在两种处理中均增高了HSP70膜表达的阳性率。两种处理均使细胞的HSP70HP(EnhancerProtein)基因表达增高 ,而以热休克处理为更明显 ,HSPA2的表达均有所下降 ,也以热休克处理更明显 ,HSF1基因在热休克处理为上调 ,而在榄香烯处理则为下调 ,与肿瘤免疫密切相关的HSP70、HSP72、HSP75及HSP90、gp96基因的表达则没有变化。结论 :榄香烯较热休克处理早期能更多地促进HepG2 细胞HSP70的膜表达 ,其机制可能是与其改变胞内已存在的HSP70的分布 ,和 或促进HSP70mRNA的翻译有关。两种处理均能改变与HSPs调控相关基因的表达 ,并可引起HSPA2基因表达下调。

JNK/SAPKs信号转导通路在榄香烯抗肝癌效应中的作用

目的:探讨JNK/SAPKs信号转导通路在榄香烯抗肝癌效应中的作用,为阐明榄香烯抗癌效应的分子机制提供参考。方法:气相色谱法检测榄香烯在Hea-F肝癌细胞内的分布。透射电镜观察SMMC7721凋亡细胞的超微结构变化。利用Western-blotting对榄香烯处理的HepG2肝癌细胞JNK/SAPKs进行的活性分析。利用RT-PCR检测榄香烯处理的SMMC7721 肝癌细胞的DAXX基因表达。结果:榄香烯标准品在8.42 min时出现洗脱峰。榄香烯处理3 b后,SMMC7721细胞开始发生具有凋亡特征的变化。榄香烯处理组HepG2细胞的JNK/SAPKs激酶活性次于热休克处理组,高于对照组。榄香烯处理的SMMC7721细胞组未见DAXX基因的表达。结论:榄香烯能够进入细胞内。其引起的肿瘤细胞凋亡可能是通过活化JNK/ SAPKs来诱导的。DAXX传人途径在榄香烯诱导的JNK/SAPKs活化过程中可能不起主要作用。

榄香烯复合瘤苗主动免疫的抗肿瘤效应

为研究我们研制的榄香烯(elemene)复合瘤苗主动免疫抗瘤效应的分子机制及其与热休克蛋白(heat shock protein,HSP)的可能关系,本文首先观察、比较厂榄香烯或/和热休克复合瘤苗主动免疫的抗瘤效应.1 材料与方法1.1 主要药品和试剂1%榄香烯注射液(批号940823,大连金港制药).25%戊二醛(E Merk).RPMI 1640全培基(Gibco RPMI 1640含15 mmol/L Hepes,2 mmol/L谷氨酰胺、常规量抗菌素、20%小牛血清,杭州四季青公司).1.2 实验动物和瘤株BALB/c系小鼠(H-2~d)和异基因型小鼠腹水型肝癌H22(H-2^-)高淋巴转移亚系以及615系小鼠(H-2~k)和其同基因型L615 T淋巴细胞性白血病,均由本室常规传代、保种.实验动物体重20～26g,按体重分类后随机分组,每组20只,雌雄各半.1.3

榄香烯复合瘤苗HSP70与HSP70_(BCG)对巨噬细胞功能影响的比较

目的 :比较Hca F榄香烯复合瘤苗HSP70 (HSP70 HTCV)和卡介苗HSP70 (HSP70 BCG)对小鼠腹腔或脾脏巨噬细胞功能的影响 ,分析HSP70 HTCV诱导抗瘤免疫作用的机制。方法 :给正常BALB C小鼠腹腔注射HSP70 HTCV 或HSP70 BCG ,共 3次 ,并用多聚甲醛固定的Hca F细胞体内冲击。收集腹腔和脾脏的巨噬细胞 ,并用HSP70 HTCV或HSP70 BCG 体外再致敏 ,用MTT法测细胞毒活性、细胞的增殖和分泌TNF的能力 ,用中性红吞噬试验测巨噬细胞的吞噬能力。结果 :用HSP70 HTCV 免疫小鼠的腹腔巨噬细胞对Hca F的细胞毒活性强于用HSP70 BCG 免疫小鼠的腹腔巨噬细胞 (4 2 7%VS 31 0 % ,P <0 0 5 ) ;用HPS70 HTCV 免疫小鼠的脾脏巨噬细胞分泌TNF的能力高于用HSP70 BCG免疫小鼠的脾脏巨噬细胞 ,细胞培养上清对L92 9的细胞毒活性分别为 5 7 4 %和 35 9% (P <0 0 5 ) ,脾脏巨噬细胞吞噬中性红的能力的变化两组之间无明显差别 ;免疫巨噬细胞的上述功能均高于未经免疫的对照小鼠的巨噬细胞 (P <0 0 1) ,而三组巨噬细胞的增殖改变无明显差别 (P >0 0 5 )。结论 :HSP70 HTCV 或HSP70 BCG 免疫都能增强巨噬细胞功能 ,但HSP70

炒紫苏子醇提物对5-脂氧酶活性和LTB4释放的影响

目的探讨炒紫苏子醇提物对5-脂氧酶(5-LO)的抑制作用。方法大鼠胸腔内注入致炎物质(角叉菜胶),制备多形核粒细胞悬液,超声破碎,得到5-脂氧酶粗提物,设阴性对照组、紫苏子12.8,25.6和51.2 mg.L-1、木犀草素5组,ELISA法检测LTB4释放水平;体外观察炒紫苏子醇提取物对5-LO和15-LO酶活性的抑制作用。结果12.8,25.6和51.2 mg.L-1炒紫苏子醇提取物及木犀草素能够明显抑制胸腔多形核粒细胞悬液LTB4释放(P值均<0.01),抑制率分别达到75.06%,79.04%,81.26%,81.43%;炒紫苏子醇提取物对5-LO酶活性具有明显的抑制作用,其IC50为79.73 mg.L-1。结论紫苏子醇提取物能够抑制5-脂氧酶酶活性。

榄香烯复合瘤苗主动免疫抗瘤效应增强途径的比较研究

将ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠的Ｈ２２ 腹水型肝癌和６１５ 系小鼠的Ｌ６１５ 白血病细胞经榄香烯或／和热休克等不同处理制成瘤苗， 进行体内主动免疫实验和致敏脾细胞的体外细胞毒活性实验。结果表明： 热休克和榄香烯复合瘤苗比单一因素处理的瘤苗免疫效果好， 经Ｈ２２和Ｌ６１５ 复合瘤苗免疫、攻击后两个月动物存活率分别达６０－０％ 、８５－０％ （ Ｐ＜０－０１）， 并且能够明显提高死亡小鼠的平均存活天数。瘤苗免疫动物脾细胞的细胞毒活性分别达５８－８％ 、６９－７％ （ Ｐ ＜ ０－０１） 。在制备复合瘤苗时先加入榄香烯后再热休克的免疫效果较好， 这在Ｌ６１５ 瘤苗更为明显， 从而为今后瘤苗免疫在临床上的应用提供了进一步的实验依据。

肿瘤患者血清细胞因子水平的变化

目的：探讨肿瘤患者免疫偏斜状态及化疗时其的纠正作用。方法：采用ＥＬＩＳＡ法测定了肿瘤患者血清ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ的水平及一线化疗后上述细胞因子的变化。结果：与正常人对照，ＩＦＮ－γ及ＴＮＦ－α呈显著下降，而 ＩＬ－２和ＩＬ－４变化不显著。正常人：ＩＦＮ－γ ２６６±１９３．５ｐｇ／ｍｌ，ＴＮＦ－α ２９１．２±６４．８ｐｇ／ｍｌ，ＩＬ－２ ３４６．２±１９８．２ｐｇ／ｍｌ，ＩＬ－４ １４８．９±４７．８ｐｇ／ｍｌ。带瘤组：ＩＦＮ－γ ４５．８±３１．２ｐｇ／ｍｌ，ＴＮＦ－α ６２．５±１４２ｐｇ／ｍｌ，ＩＬ－２ ５５２．３±７４２．５ｐｇ／ｍｌ，ＩＬ－４２４０．１±２２４．３ｐｇ／ｍｌ。术后组：ＩＦＮ－γ ３６．４±１８．８ｐｇ／ｍｌ，ＴＮＦ－α ３２．７±１５．１ｐｇ／ｍｌ，ＩＬ－２ ２４５．１±１２３ｐｇ／ｍｌ，ＩＬ－４ １２１．６±１０７．５ｐｇ／ｍｌ。化疗后ＩＦＮ－γ和ＴＮＦ－α均有不同程度回升。带瘤组化疗前：ＩＦＮ－γ ３８．４±２９ｐｇ／ｍｌ，ＴＮＦ－α １８．１±１４ｐｇ／ｍｌ；化疗后：ＩＦＮ－γ ６２±５９．４ｐｇ／ｍｌ，ＴＮＦ－α ３５．４±２５．２ｐｇ／ｍｌ。术后组化疗前：ＩＦＮ?

TLR4介导HSP70_(BCG)诱导的小鼠骨髓树突状细胞分泌IL-12

目的观察TLR4(Toll-likereceptor4)在卡介苗来源的热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70BCG)冲激的小鼠骨髓来源树突状细胞(dendriticcells,DCs)的IL-12分泌的作用。方法用rmGM-CSF和rmIL-4诱导小鼠骨髓来源的DCs,在HSP70BCG冲激前加入抗TLR4抗体,用流式细胞仪检测DCs的CD40和CD86表达;用ELISA法检测DCs上清液中的IL-12和脾T细胞上清液中的IL-2浓度。结果抗TLR4抗体对CD40和CD86的表达无明显影响,但明显抑制DCs分泌IL-12并进而抑制DCs致敏的脾细胞分泌IL-2。结论HSP70BCG可通过TLR4途径诱导DCs分泌IL-12。

非小细胞肺癌细胞p53凋亡刺激蛋白家族的表达及调节

目的:探讨p53遗传背景不同的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株中p53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族的表达和调节。方法:应用荧光定量RT-PCR方法检测细胞株中ASPP的mRNA表达以及应用Westernblot检测ASPP蛋白含量,MTT法检测不同细胞对抗肿瘤药物的敏感性。结果:顺铂处理后NCI-H157细胞株的IC50值是3.7μg/mL,A549的IC50是10.48μg/mL。NCI-H157细胞株中ASPP1、ASPP2mRNA平均表达量分别是A549的2.66倍(P=0.002)和6.98倍(P=0.03)。NCI-H157细胞株ASPP1、ASPP2蛋白表达量分别是A549的1.33倍和1.24倍。结论:ASPP家族在突变型NSCLC细胞株中的表达比在野生型细胞株中高,ASPP家族表达和肺癌细胞对抗肿瘤药物的敏感性有关,有望成为抗肿瘤治疗的新的分子靶点。

巨噬细胞在榄香烯复合瘤苗对HCa-F的免疫效应中的作用

目的 :研究巨噬细胞 (Mφ)在榄香烯复合瘤苗 (EC -TCV)对小鼠肝癌HCa-F的免疫保护效应中的应用。方法 :榄香烯复合瘤苗主动免疫 3次 ,体内用多聚甲醛固定的HCa-F致敏后 3d检测腹腔巨噬细胞 (Mφ)的抗肿瘤细胞毒活性、一氧化氮 (NO)、细胞增殖活性的功能变化。结果 :与对照组比较 ,腹腔巨噬细胞(PEMφ)对HCa -F的细胞毒活性增强 ,而在NO产生和细胞增殖方面无明显差异。结论

榄香烯复合瘤苗冲激的树突状细胞的功能研究

大多数树突状细胞(Dendritic cell,DC)来源于骨髓.在小鼠、大鼠及人的骨髓中均含有许多DC前体细胞,经体外培养能生成具有典型形态、表型及功能的非成熟的DC,抗原能使非成熟的DC转变为成熟的DC,成熟DC能表达高水平多肽-MHC复合物及共刺激分子CD86(B7-2)及CD40等,能分泌TH1型细胞因子(IL-12),能有效地将抗原提呈给初始型T细胞并使之激活.