microRNA在树鼩真菌性角膜炎中的调控网络及其生物学功能分析

筛选树鼩真菌性角膜炎发病过程中差异表达的微小RNA(microRNA,miRNA)和信使RNA(mRNA),分析其靶基因的生物学功能及信号通路,为阐明真菌性角膜炎的免疫机制及筛选其抗真菌治疗的潜在靶点提供线索。通过茄病镰刀菌液显微注射至树鼩角膜基质,诱导真菌性角膜炎的发生;使用高通量测序技术检测茄病镰刀菌感染树鼩第7天、14天和30天的角膜组织miRNA和mRNA表达谱,以自身未感染的眼角膜为对照;差异表达miRNAs的靶基因与差异表达mRNAs取交集构建miRNA-mRNA调控网络,采用实时荧光定量PCR进行验证;最后对靶基因进行GO和KEGG富集分析。结果表明:在茄病镰刀菌感染树鼩角膜第7天、14天和30天,分别有78、56、41个mRNAs和70、63、20个miRNAs显著性差异表达,其中有29个mRNAs和14个miRNAs在感染第7天、14天和30天均显著性差异表达,Has-miR-214-3p和Has-miR-149-5p处于调控网络的关键节点。GO和KEGG富集分析发现,显著性差异表达的mRNAs和miRNAs靶基因主要参与免疫反应和炎症反应,涉及Toll-like受体、NOD-like受体、NF-kB和TNF信号通路。研究结果明确了树鼩真菌性角膜炎存在miRNA-mRNA差异表达基因谱,Has-miR-214-3p、Has-miR-149-5p与树鼩真菌性角膜炎相关,可作为真菌性角膜炎发生和预后评价的潜在生物学标志物。

树鼩脊髓微血管内皮细胞的分离培养及EV71感染实验

目的建立树鼩脊髓来源的微血管内皮细胞体外分离培养技术,用7 1型肠道病毒(enterovirus 71,EV71)感染该细胞,探讨其感染特性,为EV71损伤中枢神经系统机制的研究提供基础。方法采用Ⅱ型胶原酶、分散酶、DNaseⅠ三酶联合两次消化树鼩脊髓组织后,获取微血管内皮细胞,并进行纯化和鉴定。用E V 7 1感染树鼩脊髓微血管内皮细胞,测定感染不同时间点的细胞及其培养上清液中病毒载量。采用间接免疫荧光法检测细胞中E V 7 1标志蛋白的表达,以确定EV71对树鼩脊髓微血管内皮细胞的感染性。结果分离培养获得的树鼩脊髓微血管内皮细胞呈典型的分支状和串珠状,经过嘌呤霉素纯化培养后的传代细胞主要是不规则的多角状细胞;细胞免疫荧光鉴定结果显示,微血管内皮细胞标志蛋白CD31和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)表达都呈阳性。用感染复数为1的EV71感染树鼩脊髓微血管内皮细胞,可见典型的细胞病变,且病毒滴度可达3.2×10^(6) TCID50/mL,表明EV71可成功感染树鼩脊髓微血管内皮细胞并有效增殖;而且在4 8 h内,细胞培养上清液中病毒载量呈线性升高,而细胞中病毒载量在12 h到达顶峰。间接免疫荧光法在EV71感染后12 h的树鼩脊髓微血管内皮细胞质中可检测到病毒颗粒。结论成功建立了树鼩脊髓微血管内皮细胞体外分离培养方法,确定了EV71对树鼩脊髓微血管内皮细胞的感染性和病毒增殖特性,为开展EV71入侵中枢神经系统的机制研究提供了一定基础。

肠道病毒71型致病机制及免疫反应研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)主要经由胃肠道或呼吸道传染人类,是引起手足口病的主要病原体之一,还能导致神经系统性疾病,如神经源性肺水肿,甚至死亡,严重威胁婴幼儿生命安全。虽然EV71的全病毒灭活疫苗已经上市,但其感染导致的并发症的致病机制及免疫反应尚未完全明确。本文对EV71的致病机制、免疫应答及免疫原性方面的动物实验研究进展进行综述,为深入研究EV71提供理论支持。

成年树鼩睾丸维生素D代谢酶CYP24A1表达与生育力相关研究

目的研究成年树鼩睾丸中维生素D代谢酶和维生素D受体的转录水平,检测CYP24A1的蛋白表达,探索雄性实验树鼩生殖障碍的原因。方法选择2~3岁雄性树鼩,根据个体繁殖档案分为具有成功生育史的正常组,和无生育史的生殖障碍组,每组各5只。手术摘取一侧睾丸,通过病理学观察其组织病理变化;采用实时荧光定量PCR检测睾丸组织中维生素D受体、维生素D代谢酶mRNA水平的变化,以蛋白印迹法检测CYP24A1的蛋白表达,同时用免疫荧光观察精子CYP24A1表达情况。结果正常组与生殖障碍组相比曲细精管排列更紧密,生精细胞更多。与正常组相比,生殖障碍组树鼩睾丸组织VDR、CYP2R1、CYP27A1 mRNA水平无明显差异(P>0.05),而CYP24A1在mRNA表达水平和蛋白水平都明显低于正常组(P<0.05)。同时免疫荧光结果显示正常组睾丸来源的精子在其头部、颈部和中段的CYP24A1蛋白高表达,而生殖障碍组表现为低表达或不表达。结论CYP24A1与雄性树鼩成功生育有直接联系,提示CYP24A1可以作为判断雄性树鼩生育力的重要指标。

实验树鼩肠道螺杆菌属细菌特征分析

近年来,树鼩(Tupaia belangeri)作为一种新型的实验动物被广泛应用于生物医学研究的各个领域。本研究组前期的研究结果显示,螺杆菌属(Helicobacter)是树鼩肠道微生物群落中相对丰度最高的一类细菌,但其具体的细菌种类和结构特征仍然不清楚。因此,本研究将开展实验树鼩肠道中螺杆菌属细菌的分布种类和特征分析,为后续实验研究工作提供资料。通过系统采集72只树鼩的粪便样本,提取核酸后采用巢氏PCR法应用属特异性引物扩增螺杆菌属特异性片段,再分别采用7个种特异性引物对属特异性阳性样本扩增螺杆菌种特异性片段,包括肝螺杆菌(H.hepaticus)、家鼠螺杆菌(H.muridarum)、胆汁螺杆菌(H.bilis)、啮齿类螺杆菌(H.rodentium)、弯曲螺杆菌(Flexispira rappini)、鼩螺杆菌(H.suncus)和盲肠螺杆菌(H.typhlonius)。属特异性引物扩增阳性但种引物扩增阴性的样本进行核酸序列测定和BLAST比对分析,确认其最终所属的螺杆菌种类。结果显示,72份树鼩粪便样本中,属特异性引物扩增阳性有18份,总体阳性率为25.0%。其中,盲肠螺杆菌阳性8株、胆汁螺杆菌阳性6株,其余8份阳性样本经过测序和BLAST比对分析后确认为同性恋螺杆菌(H.cinaedi)阳性5株、猫螺杆菌(H.felis)阳性2株和猕猴螺杆菌(H.macacae)阳性1株。有4份树鼩粪便样本出现同时携带盲肠螺杆菌和胆汁螺杆菌的情况。将螺杆菌属细菌携带结果与实验树鼩的性别和年龄组进行比较分析后发现,不同性别间以及不同年龄组间,属或种阳性样本情况均无差异(P>0.05)。本研究结果表明,实验树鼩具有较高的螺杆菌携带率,且不分性别和年龄,主要以盲肠螺杆菌、胆汁螺杆菌和同性恋螺杆菌为主。