人红细胞生成素单克隆抗体的制备、鉴定及应用研究

用rhEPO作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合,用碱性PAGE方法进一步分离并纯化的rhEPO,包被PVC板,对杂交瘤用ELISA方法进行筛选,获得两株稳定分泌抗hEPO单抗的杂交瘤细胞株。经鉴定分别属于IgG_1、IgG_(2b),轻链均为k链,K_d分别为5.53×10^(-10)mol/L和1.34×10^(-10)mol/L。用Western blot方法证明两者对hEPO具有高度的专一性,能特异地识别rhEPO和尿源hEPO。所制备单抗可作为亲和层析的配体,用于再生障碍性贫血病人尿中EPO及哺乳类工程细胞所表达的hEPO的分离、纯化,并可用于hEPO的定量检测。

人促红细胞生成素基因组基因和cDNA的克隆及其在COS－7细胞中的表达

利用ＰＣＲ技术，从正常人胎肝染色体ＤＮＡ中克隆到长度为１５７２ｂｐ的人促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因片段，它包含除第一个外显子和第一个内含子外所有外显子及内含子。再人工合成１３ｂｐ外显子１的编码区，并与１５７２ｂｐ片段拼接，从而得到除第一个内含子的人促红细胞生成素基因组基因。将克隆得到的ＥＰＯ基因插入载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ得到ｐＳＶ２－ＥＰＯ表达载体，转染ＣＯＳ－７细胞后获得高效表达。利用自行研制的小鼠抗人ＥＰＯ单抗及兔抗人ＥＰＯ多抗，对表达产物进行ＥＬＩＳＡ定量测定，细胞分泌ＥＰＯ量高达２５１±７Ｕ／ｍｌ．Ｋｒｙｓｔａｌ法测得体外生物活性２４１．５±６．５Ｕ／ｍｌ．用ＥＰＯ单抗免疫沉淀结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对转染细胞的表达产物做了进一步鉴定，清晰地看到了ＥＰＯ条带。从高效表达ＥＰＯ的转染细胞中分离纯化ｍＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆到ＥＰＯ的ｃＤＮＡ，这为ＥＰＯ在其它系统中的表达及ＥＰＯ的功能与结构的研究打下了基础。