随机聚合酶链反应检测未知病毒方法学的建立

目的探索并建立一种用于快速检测未知病毒的分子生物学方法。方法分别以乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)为假定的未知DNA、RNA病毒,验证随机聚合酶链反应(PCR)检测未知病毒的可行性。分离HBV、HCV的阳性血清,去除宿主DNA后,提取病毒核酸。锚定随机引物经Klenow酶处理(模板为DNA)或反转录酶作用(模板为RNA)退火至模板,随后用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增。扩增产物经纯化后克隆、测序,最后与BLAST进行比对。结果经BLAST比对证实,插入序列中有HBV和HCV的基因组片段,在病毒为1×106拷贝/ml时,被检测克隆的阳性率约为15%。目前我们利用本法能达到的检测低限大致为1×104拷贝/ml。结论成功建立了一种基于随机PCR的未知病毒检测方法,其优点在于不依赖病毒的细胞培养及其核酸序列信息。这种方法的建立为快速检测不明原因疾病和新发传染病病原体提供了新的思路。

乙型肝炎病毒与Ⅰ型干扰素系统相互作用新机制及治疗新策略的研究

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是严重危害人类健康的重要疾病之一,迄今尚无治愈药物。干扰素(interferon,IFN)由于HBeAg/HBsAg血清转换清除率较高、获得疗效后复发率低,成为临床抗乙肝病毒药物之一,但由于仅约20%~40%的患者对IFN有较好应答,其临床应用受到很大阻碍。鉴于此,国内外学者近年来利用体外HBV复制感染细胞模型及动物模型与临床乙型肝炎患者队列,采用多种研究手段,一方面研究IFN及IFN诱导的细胞基因在抗HBV及信号传导途径中的作用及新机制,另一方面研究HBV复制和蛋白表达对天然免疫信号通路、IFN诱生和抗病毒效应的影响,同时以此为基础探索优化干扰素治疗及治愈慢性乙肝的新型措施和手段。本文重点介绍了作者所在课题组的研究工作,并对未来发展提出了展望。

聚乙二醇干扰素单药与普通干扰素优化拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的初步研究

目的观察普通干扰素优化联合拉米夫定与聚乙二醇干扰素单药治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者的疗效。方法选择2009年3月至2011年11月上海市长宁区中心医院和上海市公共卫生临床中心的80例HBeAg阳性CHB患者,随机数字表分组,优化组先单用普通干扰素(500mIU,皮下注射,隔日一次)治疗,40例12周后HBVDNA载量未下降>2log10的患者联合拉米夫定(100mg/d)治疗24周后停用拉米夫定,继续普通干扰素治疗至48周;40例予聚乙二醇干扰素α-2a(180μg,皮下注射,每周一次)单药抗病毒治疗48周。采用χ2检验对两组ALT复常率、病毒学应答情况和HBeAg血清学转换率进行比较。结果 (1)两组患者治疗各时间点血清ALT复常率比较,差异无统计学意义(P>0.05);(2)优化治疗组治疗48周时,HBeAg阴转率和血清学转换率分别为39.67%和31.59%,与单药治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05);(3)优化组治疗24周即可获得较高的HBV DNA检测下限率,与单药治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05);(4)干扰素治疗期间可出现白细胞明显减少现象,优化治疗组中没有发生药物减量现象,而单药治疗组有5例在疗程中不能耐受而发生药物减量现象,两组差异有统计学意义(χ2=2.309,P<0.05)。结论两组不同治疗方法均可获得一定的HBeAg血清学转换率,普通干扰素优化拉米夫定治疗组与单药聚乙二醇干扰素疗效相似,但其不良反应发生率明显降低,经济药效比明显。

利用高压水动力法建立乙型肝炎病毒转染小鼠模型及初步评价

目的利用高压水动力法建立C57BL／6小鼠乙型肝炎病毒（HBV）转染模型，并对其进行初步的观察及药物评价。方法将10μg腺病毒相关病毒载体（pAAV）-HBVl．2质粒采用高压水动力法尾静脉注入C57BL／6小鼠体内，连续5周观察小鼠血清中的HBsAg、HBVDNA等表达情况，并利用该模型初步评价拉米夫定的抗病毒效果。结果pAAV-HBVl．2质粒高压水动力法注射C57BL／6小鼠后，在小鼠体内分泌HBV的抗原及病毒颗粒。尾静脉注射2周内小鼠血清中HBsAg阳性率为100％，连续观察至第5周，22．2％小鼠血清中HBsAg有持续表达。小鼠血清中HBVDNA水平在1～4周时含量明显高于≥10^3拷贝／mL（临床患者阳性标准）。肝组织病理学观察（HE染色）可见不同程度肝细胞炎性改变，肝组织免疫组化可见到HBsAg和HBcAg表达。另外，使用抗病毒药物拉米夫定干预该小鼠模型，其血清中HBVDNA水平明显下降。结论初步建立的C57BL／6小鼠HBV转染模型，是一个适用于药物筛选及疫苗研究的有效模型，为抗病毒治疗研究奠定了一定基础。

拉米夫定与干扰素序贯治疗高病毒载量慢性乙型肝炎的疗效观察

目的观察拉米夫定与干扰素序贯治疗高病毒载量慢性乙型肝炎的疗效,探索高病毒载量抗病毒治疗新途径。方法选取我院2011-2012年收治的高病毒载量慢性乙型肝炎患者58例,根据不同治疗方法分为治疗组(拉米夫定和干扰素序贯用药)和对照组(单用干扰素),在第12、24、48周分别检测HBV DNA、HBeAg定量及肝功能等。结果治疗组的ALT复常率及HBV DNA阴转率明显高于对照组,二者比较差异有统计学意义(P<0.05);但HBeAg血清学转换率两组间差异没有统计学意义(P>0.05)。结论拉米夫定与干扰素序贯治疗高病毒载量慢性乙型肝炎有一定疗效,值得临床推广应用。

整合型HIV DNA荧光定量检测法的临床初探

目的 建立外周血单核细胞整合型HIV DNA荧光定量ALu-PCR的检测方法.方法 收集我院就诊的病毒载量＜ 20IU/ml的艾滋病患者、耐药患者和初诊患者各10例.培养ACH2细胞系,每个细胞含有一个HIV基因组.构建pMD19T-CD3质粒,测定浓度,计算其拷贝数.选用针对HIV3＇长末端重复序列的引物ULF1,和针对人类基因高度保守的Alu1和Alu2序列的引物,对1∶5梯度稀释,共8个梯度的ACH2基因组及样本进行预扩增.将预扩增的产物用引物Lambda T、UR2及HIV Taqman探针进行整合型HIV DNA的荧光扩增;用引物CD3IN5、CD3IN3及CD3 Taqman探针对预扩增产物及1∶5梯度稀释的CD3质粒进行CD3荧光扩增.结果 以1∶5梯度稀释的CD3质粒为标准品,得到的线性回归方程y=-2.731x ＋43.01,（R2 =0.953）,根据一个人类细胞含2个CD3基因,可得到样本及ACH2的细胞数.ACH2的细胞数即HIV拷贝数为4.271×104;以1∶5梯度稀释的ACH2为标准品,回归方程为y=-3.146x ＋39.11 （R2 =0.968）计算可得样本整合型HIV DNA;用样本的整合型HIV-1 DNA/样本的CD3的拷贝数,即为单位细胞中整合型HIV拷贝数.通过对不同组间的t检验,各组间无差异（P＞0.05）.结论 该方法对于低拷贝HIV病毒量的检测有优势,提示通常的抗病毒治疗无法有效攻击潜伏库中的病毒,同时也为新的干预治疗提供了一种评价依据.