黏质沙雷氏菌产几丁质酶的发酵工艺优化

利用均匀设计法,优化一株黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)产几丁质酶培养基的组分;同时,利用正交设计法优化其摇瓶发酵产酶的条件.研究结果表明,最佳培养基组分(质量分数):0.504%胶体几丁质,1.178%酵母粉,0.025%MgSO4.7H2O,0.095%K2HPO4,0.001%FeSO4.7H2O,0.005%山梨醇,0.030%KH2PO4;最佳摇瓶发酵工艺条件:培养时间为48 h,发酵温度为30℃,初始pH值为9.0,装液量为30 mL,接种量为1%.在此优化条件下,酶活力可达9.39μkat.L-1,比未优化的产酶条件下酶活力提高了81.6%.

黏质沙雷氏菌产几丁质酶二步发酵工艺的优化

采用二步发酵法,研究黏质沙雷氏菌的产几丁质酶发酵条件.在二步发酵产酶的过程中,通过单因素法优化得到二步发酵培养基中最适碳源、氮源的质量分数和菌龄,同时选取发酵时间、初始pH值、接种菌体量和装液量4个因子进行正交试验.最终得到的最优条件:胶体几丁质质量分数为0.8%,酵母粉质量分数为1.0%,菌龄为12h,发酵时间为72h,初始pH值为8.5,菌体干质量为90mg,装液量为20mL.在此条件下,酶活力可达17.020μkat.L-1.另外,在二步发酵工艺中添加0.1%纤维素,酶活力可提高至18.804μkat.L-1,比一步发酵提高1.27倍.

采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化

以重组E.coliBL21(DE3)pLysS/pET22b-Chi C为亲本,采用易错聚合酶链反应(PCR)技术,对粘质沙雷氏菌几丁质酶C基因(Chi C)进行定向进化研究.经过两轮易错PCR后,建立突变体文库,进行平板初筛、包涵体复性及酶活检测复筛,获得一酶活较高的突变酶(Mut-Chi C),其催化活性为亲本重组酶的1.9倍,比活力为出发菌酶活的3.3倍.对突变酶的酶学性质进行初步研究,其最适pH值为5.0,最适温度为60℃,而出发菌该酶的最适温度为40℃.进化酶基因经DNA测序并通过软件与亲本型酶基因进行分析比对,表明突变酶Mut-Chi C基因发生点突变,使4处氨基酸被取代,且均为有义突变.

重组粘质沙雷氏菌几丁质酶C的纯化及酶学性质

为从已构建的重组大肠杆菌pET-22b-chiC获得高纯的几丁质酶C,通过降低培养温度,提高粘质沙雷氏菌几丁质酶C的可溶性表达.表达产物经镍柱亲和层析(IMAC)和Phenyl-Sepharose疏水层析(HIC)分离纯化后,得到电泳纯的几丁质酶.酶学性质研究表明,纯化的几丁质酶C为单体蛋白,相对分子质量为51.8ku;最适pH值为5.0,最适温度为55℃,在55℃的条件下保温4 h后仍有90%以上的酶活力.研究结果还表明,Cu2+,Hg2+,Co2+,Mg2+对酶活力均有明显抑制作用,而Fe2+,Zn2+,Sn2+,Ba2+对酶活力有一定促进作用,Mn2+对酶活力明显促进作用.

重组基因工程菌几丁质酶C的可溶性表达研究

在不同培养温度条件下对产几丁质酶C的基因工程菌BL21(DE3)进行诱导,使其表达可溶性蛋白。随后在较佳培养温度诱导条件的基础上向培养基中添加不同浓度的甘油,甘氨酸,山梨醇/甜菜碱等成分来更进一步的提高几丁质酶C的可溶性表达。其结果是在25℃诱导条件下,以添加2 g/L葡萄糖的LB培养基作为基础培养基进行培养,在基础培养基中添加3 g/L甘油的总酶活最高,达到了18.17 U/mL,较之仅含2 g/L葡萄糖的LB培养基在37℃及25℃诱导培养条件下酶活力分别提高了41.6%和20.3%;添加0.3%甘氨酸约90%的可溶性几丁质酶表达到了胞外,胞外酶活达到14.68 U/mL;添加0.5 M山梨醇/2.5 mM甜菜碱工程菌胞内酶活达到最高,为8.43 U/mL。结果表明适当降低工程菌诱导表达时的培养温度提高了几丁质酶C的可溶性表达,在较佳温诱导表达的基础上向培养基中添加不同浓度的甘油,甘氨酸,山梨醇/甜菜碱更进一步的提高了几丁质酶C的可溶性表达。

黏质沙雷氏菌产几丁质酶二步发酵工艺的优化

采用二步发酵法对…株黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的产几丁质酶发酵条件进行研究，以期在已优化的一步发酵的基础上酶活力得到进一步提高。在二步发酵产酶的过程中，通过单因素法优化得到二步发酵培养基的最适碳源、氮源浓度和菌龄，同时选取发酵时间、初始pH、接种菌体量和装液量4个因子进行正交试验。最终得到的最优条件为：胶体几丁质0．8％，酵母粉1．0％，菌龄12h，发酵时间72h，初始pH8．5，菌体干重90mg，装液量20mL。在此条件下，酶活力可达1．021U·mL^-1。在二步发酵工艺中另添加0．1％纤维素，酶活力可提高至1．128U／mL，比一步发酵提高了1．27倍。

黏质沙雷氏菌胞外几丁质酶的纯化及特性

黏质沙雷氏菌几丁质酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-琼脂糖凝胶阴离子交换层析和苯基-琼脂糖凝胶疏水层析,得到电泳纯的几丁质酶和几丁质结合蛋白CBP21。该几丁质酶和CBP21分子质量分别约为58 ku和21 ku,CBP21对该几丁质酶水解几丁质增效明显。几丁质酶反应最适温度为50℃,最适pH约为6.5～7.0。该酶在55℃以下、pH 4.5～8.0范围内稳定。酶的Km值为0.22 mg/mL,Vm为1.26μmol/(min.mg)。金属离子K+、Sn2+、Mn2+对酶有一定激活作用,而Pb2+、Hg2+和Cu2+则强烈抑制其活性。该几丁质酶的糖基含量约为3.3%。EDTA和2-ME可分别提高酶活力65%和105%。H2O2强烈抑制酶活力,提示其活性中心可能存在硫氢基。

富硒酵母及其在养猪生产上的应用研究进展

1硒与富硒酵母硒是一种重要的微量元素，参与机体过氧化物的分解和自由基的清除，提高机体免疫力。硒按存在形式常分为有机硒和无机硒。无机硒包括亚硒酸盐、硒酸盐、硒化物和元素硒，有机硒包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒代半胱氨酸。无机硒很难被动物和人体直接吸收利用，而机体可以通过肠壁的主动运输吸收利用有机硒。硒经胃肠道吸收后，通过血液运输至各组织，主要分布于肾、肝、胰、垂体及毛发等部位，而肌肉、骨骼中相对较少。硒主要以硒代半胱氨酸的形式存在于蛋白质中。目前获得有机硒的方法主要有微生物转化法、植物天然种子发芽转化法、动物转化法等。其中微生物转化法多是培养富硒酵母，所用菌种多为啤酒酵母（刘培丽等，2012）。

动物微生态制剂在宠物领域的应用现状及研究进展

动物微生态制剂是在动物微生态理论指导下,采用益生菌制成的活菌制剂。本文主要结合国内外的研究资料,对动物微生态制剂在宠物领域的应用现状、研究进展及存在的问题进行综述。