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脱氧核糖醛缩酶与醇脱氢酶共催化合成(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯
1
作者
旋凯昂
张荣珍
+1 位作者
饶俊超
徐岩
《食品与生物技术学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第2期25-31,共7页
为实现生物法“一步”合成他汀类药物侧链中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯,采用生物偶联的方法分别构建不同抗性的两种重组质粒,即来源于Streptococcus suis的脱氧核糖醛缩酶基因与Lodderomyces elongisporus的醇脱氢酶基因的重...
为实现生物法“一步”合成他汀类药物侧链中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯,采用生物偶联的方法分别构建不同抗性的两种重组质粒,即来源于Streptococcus suis的脱氧核糖醛缩酶基因与Lodderomyces elongisporus的醇脱氢酶基因的重组质粒,将两种重组质粒共转化于大肠杆菌BL21同一细胞中,实现两种酶的可溶性共表达。以重组大肠杆菌为生物催化剂,全细胞催化两种底物:400 mmol/L乙醛与200 mmol/L氯乙醛发生反应,获得产物(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯。在缺少标准产物对照的条件下,利用质谱(MS)以及氢谱(1H-NMR)进行产物鉴定,最终确定合成的产物为他汀类药物侧链中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯。
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关键词
他汀类药物侧链中间体
(3R
5S)-6-氯-2
4
6-三脱氧己内酯
生物偶联
全细胞催化
产物鉴定
下载PDF
职称材料
Pseudomonas putida KT2440低特异性L-苏氨酸醛缩酶的表达、酶学性质及温度稳定性提高
被引量:
1
2
作者
李利宏
张荣珍
+4 位作者
周丽仙
柳志永
旋凯昂
饶俊超
徐岩
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第10期2013-2023,共11页
【目的】从Pseudomonas putida KT2440基因组中,钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(lta E),构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质,和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。【方法】以P. putida KT2440基因组DNA为模板,PCR扩增...
【目的】从Pseudomonas putida KT2440基因组中,钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(lta E),构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质,和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。【方法】以P. putida KT2440基因组DNA为模板,PCR扩增出lta E基因,构建重组表达质粒p ET28a-KT2440并转化Escherichia coli BL21 (DE3),获得重组菌E. coli BL21 (DE3)/p ET-KT2440,利用Ni2+柱亲和层析纯化低特异性L-苏氨酸醛缩酶(LTA),对关键氨基酸位点Thr206和Lys207实施定点突变。【结果】SDS-PAGE结果表明LTA在大肠杆菌中获得高效表达,分子量为40k Da左右,与理论值大小相符。Ni2+柱亲和层析纯化LTA,获得单一条带。利用双酶耦联法测得LTA酶活为5577.3U/mg,最适反应温度为50°C,最适p H为8.0。在温度低于45°C,p H 5.0-9.0时,重组酶较稳定。LTA酶的Km和kcat值为23.95 mmol/L和19216.6 s–1。Mg2+、Ca2+金属离子对LTA有明显的促进作用,而Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等对酶有明显的抑制作用。该酶在叔丁基甲基醚溶剂中具有良好的耐受性,在叔丁基甲基醚中保存1h后仍保留90%以上的酶活。Thr206Ser突变明显提高了酶对温度的稳定性。Lys207对酶催化功能是必需的,该位点突变对酶活都是致死的。【结论】克隆并表达P. putida KT2440的LTA酶,研究了酶学性质,通过定点改造提高了酶的温度稳定性,筛选获得一种酶耐受性好的有机溶剂,为LTA酶在有机溶剂中高效稳定催化β-羟基-α-氨基酸奠定了较坚实的研究基础。
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关键词
恶臭假单胞菌
低特异性L-苏氨酸醛缩酶
酶学性质
致死突变
温度稳定性
原文传递
题名
脱氧核糖醛缩酶与醇脱氢酶共催化合成(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯
1
作者
旋凯昂
张荣珍
饶俊超
徐岩
机构
江南大学生物工程学院
江南大学工业微生物教育部重点实验室
出处
《食品与生物技术学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第2期25-31,共7页
基金
国家自然科学基金项目(31970045)
江苏省“六大人才”高峰高层次人才项目(2015-SWYY-010)
+2 种基金
国家轻工技术与工程双一流学科项目(LITE2018-12)
高校人才引进项目(111-2-06)
江苏高校品牌专业建设工程资助项目。
文摘
为实现生物法“一步”合成他汀类药物侧链中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯,采用生物偶联的方法分别构建不同抗性的两种重组质粒,即来源于Streptococcus suis的脱氧核糖醛缩酶基因与Lodderomyces elongisporus的醇脱氢酶基因的重组质粒,将两种重组质粒共转化于大肠杆菌BL21同一细胞中,实现两种酶的可溶性共表达。以重组大肠杆菌为生物催化剂,全细胞催化两种底物:400 mmol/L乙醛与200 mmol/L氯乙醛发生反应,获得产物(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯。在缺少标准产物对照的条件下,利用质谱(MS)以及氢谱(1H-NMR)进行产物鉴定,最终确定合成的产物为他汀类药物侧链中间体(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯。
关键词
他汀类药物侧链中间体
(3R
5S)-6-氯-2
4
6-三脱氧己内酯
生物偶联
全细胞催化
产物鉴定
Keywords
side chain intermediate
(3R
5S)-6-chloro-2
4
6-trideoxy-erythro-hexonolactone
biological coupling
whole-cell catalysis
product identification
分类号
Q819 [生物学—生物工程]
下载PDF
职称材料
题名
Pseudomonas putida KT2440低特异性L-苏氨酸醛缩酶的表达、酶学性质及温度稳定性提高
被引量:
1
2
作者
李利宏
张荣珍
周丽仙
柳志永
旋凯昂
饶俊超
徐岩
机构
江南大学生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室
出处
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第10期2013-2023,共11页
基金
国家自然科学基金(31370100)
江苏省六大人才高峰高层次人才资助项目(2015-SWYY-010)
高等学校学科创新引智计划资助(111-2-06)~~
文摘
【目的】从Pseudomonas putida KT2440基因组中,钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(lta E),构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质,和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。【方法】以P. putida KT2440基因组DNA为模板,PCR扩增出lta E基因,构建重组表达质粒p ET28a-KT2440并转化Escherichia coli BL21 (DE3),获得重组菌E. coli BL21 (DE3)/p ET-KT2440,利用Ni2+柱亲和层析纯化低特异性L-苏氨酸醛缩酶(LTA),对关键氨基酸位点Thr206和Lys207实施定点突变。【结果】SDS-PAGE结果表明LTA在大肠杆菌中获得高效表达,分子量为40k Da左右,与理论值大小相符。Ni2+柱亲和层析纯化LTA,获得单一条带。利用双酶耦联法测得LTA酶活为5577.3U/mg,最适反应温度为50°C,最适p H为8.0。在温度低于45°C,p H 5.0-9.0时,重组酶较稳定。LTA酶的Km和kcat值为23.95 mmol/L和19216.6 s–1。Mg2+、Ca2+金属离子对LTA有明显的促进作用,而Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等对酶有明显的抑制作用。该酶在叔丁基甲基醚溶剂中具有良好的耐受性,在叔丁基甲基醚中保存1h后仍保留90%以上的酶活。Thr206Ser突变明显提高了酶对温度的稳定性。Lys207对酶催化功能是必需的,该位点突变对酶活都是致死的。【结论】克隆并表达P. putida KT2440的LTA酶,研究了酶学性质,通过定点改造提高了酶的温度稳定性,筛选获得一种酶耐受性好的有机溶剂,为LTA酶在有机溶剂中高效稳定催化β-羟基-α-氨基酸奠定了较坚实的研究基础。
关键词
恶臭假单胞菌
低特异性L-苏氨酸醛缩酶
酶学性质
致死突变
温度稳定性
Keywords
Pseudomonas putida
low-specificity L-threonine aldolase
characterization
lethal mutation
thermal stability
分类号
Q55 [生物学—生物化学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
脱氧核糖醛缩酶与醇脱氢酶共催化合成(3R,5S)-6-氯-2,4,6-三脱氧己内酯
旋凯昂
张荣珍
饶俊超
徐岩
《食品与生物技术学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
0
下载PDF
职称材料
2
Pseudomonas putida KT2440低特异性L-苏氨酸醛缩酶的表达、酶学性质及温度稳定性提高
李利宏
张荣珍
周丽仙
柳志永
旋凯昂
饶俊超
徐岩
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019
1
原文传递
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