circCDR1as/miR-7-5p/RAF1轴参与调控激素性股骨头坏死中的自噬

背景:自噬可能参与激素性股骨头坏死的病理过程。有研究证实环状RNA(circular RNA,circRNA)在激素性股骨头坏死中具有调控机制,然而,circCDR1as是否在激素性股骨头坏死中影响自噬尚未被研究。目的:探讨激素性股骨头坏死中自噬水平及circCDR1as的调控机制。方法:①从GSE26316数据集中获取激素性股骨头坏死及对照组大鼠的基因表达谱并进行差异表达分析,随后分析差异表达基因的生物学功能。通过数据库预测circCDR1as的靶标miRNAs及靶标基因。比较靶标基因与差异表达基因,构建circCDR1as的调控网络。②收集激素性股骨头坏死患者及健康对照人群的股骨头样本;同时应用骨髓间充质干细胞进行细胞实验:随机分为骨髓间充质干细胞组、模型组(甲泼尼龙处理)、模型+si-NC组、模型+si-CDR1as组。利用RT-qPCR检测组织和细胞circCDR1as及靶标基因的表达,Western blot检测自噬相关蛋白的表达。③构建荧光素酶报告基因载体:pmirGLO-CDR1as(WT)、pmirGLO-RAF1(WT)、pmirGLO-CDR1as(MUT)和pmirGLO-RAF1(MUT),转染到细胞中,并设miR-7-5p mimic和mimic NC组,检测circCDR1as网络的靶向调控关系。结果与结论:①大鼠激素性股骨头坏死组与对照组之间鉴定了1283个差异表达基因,主要参与细胞凋亡和自噬信号通路。预测发现circCDR1as靶向调控6个miRNAs,这些miRNAs靶向调控305个靶标基因,其中有31个靶标基因在激素性股骨头坏死中差异表达,RAF1参与自噬被选择为关键基因,并构建了circCDR1as/miR-7-5p/RAF1的调控网络。②与对照组比较,circCDR1as,RAF1和自噬水平在激素性股骨头坏死患者及激素诱导的骨髓间充质干细胞中表达上调(P<0.05),miR-7-5p表达下调(P<0.05);敲降circCDR1as后细胞自噬水平显著下降(P<0.05)。③双荧光素酶报告检测证实了circCDR1as与miR-7-5p以及miR-7-5p与RAF1的靶向调控关系。④结论:CircCDR1as/miR-7-5p/RAF1可能通过自噬信号促进激素性股骨头坏死,靶向circCDR1as是通过部分自噬修复治疗激素性股骨头坏死的潜在策略。

CircRNA YAP1对股骨头微血管内皮细胞血管生成的作用研究

目的:探讨环状RNA(circRNA)YAP1对激素性股骨头坏死(SONFH)大鼠股骨头微血管内皮细胞(MVECs)血管生成的作用与机制。方法:成年雄性SD大鼠接受甲基强的松龙(MPS,20mg·kg^(-1)·d^(-1)肌肉注射3周,以诱导SONFH模型(n=30只)。Ctrl组(n=30只)注射等量生理盐水。用micro-CT扫描和HE染色评估是否造模成功。分离大鼠的股骨头MVECs。并用CD31蛋白作为标志物用免疫荧光化学法(IF)鉴定股骨头MVECs。将MVECs分为过表达circRNA YAP1组(pcDNA-YAP1组)、阴性对照组(pcDNA-NC组)、以及pcDNA-YAP1联合Wnt1/β-catenin通路拮抗剂dickkopf-1处理组(pcDNA-YAP1+dickkopf-1组)。用qPCR检测circRNA YAP1表达,Western blot法分别检测Wnt1、β-catenin、VEGF-A和vimentin的表达。用CCK-8实验检测各组细胞的增殖活性。Transwell小室检测细胞的迁移率。管形成实验检测细胞的血管生成能力。结果:HE染色结果显示Ctrl组表现为健康状态,无骨坏死,SONFH组大鼠均重度股骨头坏死,股骨头恶化。micro-CT扫描的结果显示Ctrl组表现骨小梁致密规则,骨小梁数量和形态均正常,SONFH组伴空骨陷窝,骨小梁减少,骨小梁缩短。与Ctrl组(1.00±0.08;1.00±0.12;1.00±0.15)比较,SONFH组股骨组织中circRNA YAP1(0.27±0.04)、Wnt1(0.49±0.03)、β-catenin(0.33±0.03)表达量均显著减少(t=12.158,P=0.009;t=10.596,P=0.012;t=10.080,P=0.014)。另外,成功分离Ctrl组和SONFH组的股骨头MVECs。与Ctrl组(1.00±0.00;1.00±0.02;1.00±0.01)比,SONFH组股骨头MVECs中circRNA YAP1(0.15±0.01)、Wnt1(0.28±0.05)、β-catenin(0.31±0.02)表达量都显著减少(t=17.625,P=0.004;t=16.154,P=0.005;t=13.596,P=0.007)。在MVECs中,与pcDNA-NC组比,pcDNA-YAP1组的circRNA YAP1、Wnt1、β-catenin、VEGF-A和vimentin的表达均上调,细胞增殖率、细胞迁移以及小管形成率都明显增加(均P<0.05)。与pcDNA-YAP1组比,pcDNA-YAP1+dickkopf-1组的circRNA YAP1表达变化无统计学意义(P>0.05),而Wnt1、β-catenin、VEGF-A和vimentin的表达均下调,细胞增殖率、细胞迁移、以及小管形成率都明显被抑制(均P<0.05)。结论:CircRNA YAP1通过激活Wnt1/β-catenin通路促进SONFH大鼠的骨血管内皮细胞的血管生成。

miR-7对激素性股骨头缺血坏死细胞模型成骨分化的影响及内质网应激介导的凋亡机制

目的:探讨微小RNA-7 (miR-7)对激素性股骨头缺血坏死(SANFH)体外细胞模型的影响,并阐明其作用机制。方法:将慢病毒miR-7模拟物(miR-7 mimic)和miR阴性对照(miR NC)转染至成骨细胞系MC3T3-E1中,同时设对照组,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组MC3T3-E1细胞中miR-7转染情况。MC3T3-E1细胞分为对照组、 SANFH组、 miR-7mimic组和miR-7 mimic+衣霉素(TM)组,甲基强的松龙刺激细胞模拟SANFH离体状态,并以TM激活内质网应激反应。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,TUNEL染色法检测各组细胞TUNEL阳性率,碱性磷酸酶(ALP)染色法观察各组细胞ALP染色情况,比色法检测各组细胞中ALP水平,茜素红S染色观察各组细胞矿化结节形成情况,RT-qPCR法和Western blotting法检测各组细胞中Runt相关转录因子2 (Runx2)、骨钙蛋白(OCN)和骨桥蛋白(OPN)mRNA及蛋白表达水平,Western blotting法检测各组细胞中葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-12、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平,免疫荧光双标记染色法检测各组细胞中GRP78和Caspase-3蛋白表达荧光强度。结果:与对照组和miR NC组比较,miR-7 mimic组细胞中miR-7表达水平明显升高(P<0.05)。与对照组比较,SANFH组细胞增殖活性明显降低(P<0.05),细胞凋亡率和TUNEL阳性率明显升高(P<0.05),ALP染色细胞较少且ALP活性明显降低(P<0.05),细胞中矿化结节形成减少,细胞中Runx2、 OCN和OPN mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞中GRP78、 CHOP、Caspase-12、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05),细胞中GRP78和Caspase-3蛋白表达荧光强度明显升高(P<0.05);与SANFH组比较,miR-7 mimic组细胞增殖活性明显升高(P<0.05),细胞凋亡率和TUNEL阳性率明显降低(P<0.05),ALP染色细胞增加且ALP活性明显升高(P<0.05),细胞中矿化结节形成明显增加,细胞中Runx2、OCN和OPN mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05),GRP78、CHOP、Caspase-12、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞中GRP78和Caspase-3蛋白表达荧光强度明显降低(P<0.05);与miR-7 mimic组比较,miR-7 mimic+TM组细胞增殖活性明显降低(P<0.05),细胞凋亡率和TUNEL阳性率明显升高(P<0.05),ALP染色细胞较少且ALP活性明显降低(P<0.05),细胞中矿化结节形成减少,细胞中Runx2、OCN和OPN mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞中GRP78、CHOP、Caspase-12、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05),细胞中GRP78和Caspase-3蛋白表达荧光强度明显升高(P<0.05)。结论:miR-7能够促进SANFH状态下MC3T3-E1细胞的成骨分化作用,该机制可能与抑制内质网应激介导的凋亡途径有关。

敲低CircCDR1as在糖皮质激素诱导的骨微血管内皮细胞活性及血管生成中的作用研究

目的:探究敲低环状RNA小脑变性相关蛋白1反义转录物(Circular RNAantisense to the cerebellar degeneration related protein 1 transcript,circCDR1as)对糖皮质激素诱导的人股骨头骨微血管内皮细胞(bone microvascular endothelial cells,BMECs)活性及血管生成的影响。方法:收集糖皮质激素诱导的股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)患者股骨头组织,HE染色观察组织病理学特征,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测CircCDR1as表达变化;获取全髋关节置换术患者的无病变股骨头,分离与培养BMECs,通过流式细胞术检测细胞表面标记物CD31、CD34、CD45、CD54、CD144和CD117表达与细胞免疫荧光染色检测CD31与vWF表达来鉴定BMECs;实验分组包括对照组、GC组、shNC+GC组和shCDR1as+GC组,通过糖皮质激素氢化可的松处理细胞以及shCDR1as、shNC转染细胞进行对应处理,qRT-PCR检测CircCDR1as表达变化,MTT法和EdU染色检测细胞增殖水平,体外成管实验观察细胞管腔形成情况,Western blot测定血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)与血管内皮细胞因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)的蛋白表达。结果:ONFH患者股骨头组织内骨髓坏死并有空骨腔出现,CircCDR1as相对表达量显著高于对照组(P<0.05);观察到分离的细胞生长状态良好,CD31、CD54和CD144均呈阳性表达,CD34、CD45和CD117均呈阴性表达,细胞内CD31与vWF的免疫荧光表达明显,由此说明成功分离到BMECs;与对照组比较,GC组CircCDR1as相对表达量上调,细胞增殖活性下降,EdU阳性细胞率降低,细胞形成的管腔数目减少,VEGF与VEGFR-2蛋白相对表达量下调,差异均具有统计学意义(P<0.05);与shNC+GC组比较,shCDR1as+GC组CircCDR1as相对表达量下调,细胞增殖活性与EdU阳性细胞率均升高,细胞形成的管腔数目增加,同时,VEGF与VEGFR-2蛋白相对表达量上调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:患者股骨头坏死组织内CircCDR1as高表达,敲低CircCDR1as能够在体外抑制糖皮质激素诱导的BMECs活性下降,促进血管生成,从而对BMECs起到保护作用。